Активность над(ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови у детей раннего возраста с гипертрофией глоточной миндалины Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология 2014, Т. 16, № 4, стр. 381-384 © 2014, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения Short communications

Meditsinskaya Immunologiya/ Medical Immunology 2014, Vol. 16, No 4, pp. 381-384 © 2014, SPb RAACI

АКТИВНОСТЬ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА С ГИПЕРТРОФИЕЙ ГЛОТОЧНОЙ МИНДАЛИНЫ

Куртасова Л.М.1, Шмидт А.Р.2, Лубнина Т.В.2

1ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, г. Красноярск, Россия

2КГБУЗ «Красноярский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД», г. Красноярск, Россия

Резюме. Обследованы 57 детей с гипертрофией глоточной миндалины в возрасте 1-3 лет. Контрольную группу составили 35 здоровых детей. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови исследовали биолюминесцентным методом. В лимфоцитах крови у детей с гипертрофией глоточной миндалины наблюдается активация аэробного дыхания, увеличивается активность пластических процессов, зависящих от интенсивности пентозофосфатного цикла, отмечается уменьшение роли малатаспартатного шунта в энергетике клетки, снижение анаэробной реакции НАДНЛДГ, понижается уровень взаимодействия между циклом Кребса и реакциями аминокислотного обмена, снижается активность глутатионредуктазы. Ключевые слова: лимфоциты, ферменты, гипертрофия глоточной миндалины

Введение

Распространенность хронической оторино-ларингологической патологии у детей в Российской Федерации составляет от 181,9 до 465 на 1000 детского населения, при этом аденотон-зиллярная патология занимает ведущее место. Эпидемиологические исследования, проведенные Н.В. Терсковой с соавт. (2013), показали, что в городе Красноярске увеличение в размерах и воспаление глоточной миндалины в детском возрасте — одна из самых распространенных патологий среди всех заболеваний верхних дыхательных путей [2]. В то же время известно, что хронические заболевания ЛОР-органов у детей могут способствовать снижению функциональной активности иммунной системы.

Учитывая, что все модуляторы функциональной активности лимфоцитов, основного структурно-функционального элемента иммунной системы, прежде всего изменяют метаболизм клетки, переключая субстратный поток с одного метаболического пути на другой, влияя на энер-

гетику клетки и синтетические процессы, можно предположить, что изменения иммунного гомео-стаза не могут не иметь метаболической основы.

В связи с чем целью данного исследования явилось изучение показателей активности НАДи НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей в возрасте 1-3 лет с гипертрофией глоточной миндалины.

Материалы и методы

Обследованы 57 детей в возрасте от одного года до трех лет (средний возраст — 2,12±0,77) лет с гипертрофией глоточной миндалины. Диагноз: гипертрофия глоточной миндалины был установлен на основании жалоб и клинической картины: затруднение носового дыхания, дыхание через рот, отделяемое из носа, храп в ночное время; эндоскопической картины: наличие аденоидных вегетаций II, III степени в полости носоглотки; данных передней активной риноманометрии. Контрольную группу составили 35 практически здоровых ребенка аналогичного возраста.

Авторы:

Куртасова Л.М. — д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, г. Красноярск, Россия

Шмидт А.Р. — врач-педиатр, КГБУЗ «Красноярский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД», г. Красноярск, Россия

Лубнина Т.В. — врач-педиатр, КГБУЗ «Красноярский краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД», г. Красноярск, Россия

Адрес для переписки:

Куртасова Людмила Михайловна

д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии ГБОУ ВПО

«Красноярский государственный медицинский университет имени

проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России

660022, Россия, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1.

Тел.: 8 (391) 220-06-28.

Факс: 8 (391) 221-16-38.

E-mail: [email protected]

Поступила 21.02.2014 Принята к печати 26.03.2014

© Куртасова Л.М. и соавт., 2014

Куртасова Л.М., Шмидт А.Р., Лубнина Т.В. KurtasovaL.M., ShmidtA.R., Lubnina T.V.

Медицинская Иммунология Meditsinskaya Immunologiya/Medical Immunology

Мононуклеары выделяли из цельной гепари-низированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина [4]. Затем осуществляли биолюминесцентное определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), НАД и НАДН-зависимой лактатдеги-дрогеназы (НАДЛДГ и НАДНЛДГ соответственно), НАД- и НАДН-зависимой малатдегидроге-назы (НАДМДГ и НАДНМДГ соответственно), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогена-зы (НАДГДГ и НАДНГДГ соответственно), НАДи НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ соответственно), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидро-геназы (НАДФГДГ и НАДФНГДГ соответственно), малатдегидрогеназы декарбоксилирующей (НАДФМДГ) и глутатионредуктазы (ГР) [1]. Активность исследуемых оксидоредуктаз выражали в ферментативных единицах [1Е = 1 мкмоль/мин на 104 клеток]. Исследование проводили на ферментативном препарате NAD(P): FMN оксидо-редуктаза-люцифераза из Photobacterium leiognatli (полученном в Институте Биофизики СО РАН, г. Красноярск). Измерение уровня биолюминесценции осуществляли на биолюминометре «БЛМ 8801» (Россия).

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью пакета прикладных программ «Statistica v.6.0» (Stat Soft Ins., США). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде М — средней арифметической величины и ошибки средней арифметической (m). Оценка статистической значимости различий средних величин проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. При этом значения р могли ранжироваться по трем уровням достигнутых статистически значимых различий: р < 0,05; р < 0,01; р < 0,001.

Результаты и обсуждение

При исследовании показателей активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины выявлено повышение уровня активности Г6ФДГ относительно контрольных величин (табл. 1). Глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа является инициирующим ферментом пентозо-фосфатного пути (ПФП) и участвует в перераспределении части глюкозы с энергетических нужд клетки на пластические [8]. В результате деятельности ПФП, в том числе Г6ФДГ, в больших количествах образуется НАДФН, необходимый для реакций биосинтеза липидов и для регуляции восстановленного глутатиона — важного эндогенного анти-оксиданта [11]. Кроме того, одним из продуктов ПФП является рибозо-5-фосфат, который используется для дальнейшего макромолекулярно-го синтеза [8, 10].

Следовательно, активация работы ПФП может увеличивать способность клетки к синтезу нуклеотидов. В то же время, увеличение интенсивности работы ПФП, несомненно, будет способствовать снижению в клетке количества глюкозы, доступной для использования в реакциях энергетического обмена.

Таким образом, при повышенном оттоке глюкозо-6-фосфата в ПФП, уровень реакций гликолиза будет понижен. Вероятно, это свидетельствует об уменьшении в лимфоцитах периферической крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины по сравнению с контрольными параметрами активности анаэробной реакции ЛДГ, в ходе которой регенерируется НАД+, необходимый для циклической гликолитической оксидоредуктации.

Ферментативная реакция, которая может компенсировать отток субстратов с гликолиза, катализируется Г3ФДГ, активность, которой повышена в лимфоцитах крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины (табл. 1) [5].

Необходимо отметить, что энергетический потенциал лимфоцитов определяется не только интенсивностью анаэробного окисления глюкозы, но и аэробными процессами. В значительной степени аэробные процессы зависят от активности ферментов цикла Кребса.

Результаты проведенных исследований обнаружили увеличение уровней активности НАДИЦДГ, НДДФИЦДГ и НАДМДГ в лимфоцитах периферической крови в 3,37, 6,96 и 2,41 раза, соответственно, в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины относительно показателей контрольной группы (табл. 1), что определяет

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-

ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ (мкЕ) В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ГИПЕРТРОФИЕЙ ГЛОТОЧНОЙ МИНДАЛИНЫ (М±т)

Показатель Контрольная группа (n = 35) Больные дети (n = 57) р

Г6ФДГ 2,33±0,22 10,05±1,15 < 0,001

Г3ФДГ 2,27±0,19 3,41±0,24 < 0,001

НАДЛДГ 40,93±4,04 29,80±3,01 < 0,05

НАДМДГ 20,30±1,96 48,93±4,62 < 0,001

НАДФМДГ 4,80±0,45 6,32±0,12 < 0,001

НАДФГДГ 2,52±0,20 0,55±0,05 < 0,001

НАДГДГ 4,09±0,41 2,94±0,19 < 0,02

НАДИЦДГ 1,56±0,15 5,26±0,52 < 0,001

НАДФИЦДГ 10,17±1,17 70,76±8,10 < 0,001

НАДНЛДГ 78,97±7,18 26,11±2,02 < 0,001

НАДНМДГ 114,60±10,95 90,88±8,30 0,1 < р > 0,05

ГР 11,87±1,40 7,43±0,64 < 0,001

НАДНГДГ 188,70±17,58 20,42±2,25 < 0,001

НАДФНГДГ 174,61±17,47 52,62±5,23 < 0,001

Примечание. р - статистически значимые различия с показателями контрольной группы.

2014, Т. 16, № 4 2014, Vol. 16, Ко 4

Активность оксидоредуктаз лимфоцитов при ЛОР-патологии Lymphocytes oxide reductases in ORL disorders

повышение интенсивности субтратного потока по циклу трикарбоновых кислот.

Кроме того, в лимфоцитах крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины относительно группы контроля выявлено повышение активности НАДФМДГ, которая шунтирует «медленные» реакции цикла Кребса и является ключевым ферментом липидного анаболизма [6].

В то же время следует отметить, что высокий уровень интенсивности субстратного потока по циклу Кребса в лимфоцитах крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины не определяет увеличение оттока интермедиатов через НАДНГДГ и НАДНФГДГ на реакции аминокислотного обмена (табл. 1).

Известно, что одной из метаболических систем, поддерживающих водородный градиент, является малат-аспартатный шунт, ключевую реакцию которого осуществляет НАДНМДГ [4, 8]. Как следует из таблицы 1 в лимфоцитах крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины активность НАДНМДГ снижена относительно параметров контрольной группы.

При исследовании активности изучаемых оксидоредуктаз в лимфоцитах периферической крови установлено статистически значимое снижение аэробной реакции ЛДГ в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины по сравнению с контрольными величинами (табл. 1).

В группе детей с гипертрофией глоточной миндалины в лимфоцитах крови снижены активность НАДГДГ и уровень НАДФГДГ, что отражает понижение окислительного дезаминирования глутамата и восстановительного аминирования а-оксоглутарата.

В лимфоцитах периферической крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины по сравнению с показателями контрольной группы снижен уровень активности ГР. Уменьшение активности данного энзима в лимфоцитах крови характеризует понижение антиоксидантной защиты клетки. Известно, что ГР — фермент, осуществляющий восстановление глутатиона за счет окисления НАДФН, что определяет его функциональную важность в реакциях глутатионзависи-мой антиоксидантной системы [11]. В то же время данный фермент содержится в хроматине клеточных ядер, где участвует в пролифератив-ных процессах [9].

Заключение

Полученные нами данные выявили повышенный отток субстратов через Г6ФДГ на пластические процессы в лимфоцитах крови в группе детей с гипертрофией глоточной миндалины. Следует отметить в данной группе детей пониженную интенсивность анаэробного окисления глюкозы в лимфоцитах периферической крови.

При этом повышение активности Г3ФДГ — фермента, который характеризует интенсивность липидного катаболизма и осуществляет перенос его продуктов на окислительно-восстановительные реакции гликолиза — не компенсирует низкий уровень субстратного потока по анаэробному гликолизу в лимфоцитах крови у детей с гипертрофией глоточной миндалины.

Ингибирование анаэробной и аэробной реакции ЛДГ, с одной стороны, свидетельствует о снижении возможности окисления цитоплаз-матического НАДН, что может способствовать постоянному ингибированию гликолиза на уровне гексокиназы и фосфофруктокиназы, с другой — об ослаблении способности лимфоцитов метаболизировать эндогенный лактат при аэробном дыхании.

В лимфоцитах крови у детей с гипертрофией глоточной миндалины наблюдается высокий уровень субстратного потока по циклу трикар-боновых кислот, вносящему наибольший вклад в процессы внутриклеточного энергообразования. Однако уровень субстратного взаимодействия между циклом Кребса и реакциями аминокислотного обмена снижен. Кроме того, в лимфоцитах крови у детей с гипертрофией глоточной миндалины обнаружено снижение роли малатаспартатного шунта в энергетическом внутриклеточном обмене.

Необходимо отметить уменьшение активности глутатионредуктазы у детей с гипертрофией глоточной миндалины, что может привести, во-первых, к повышению интенсивности внутриклеточных перекисных процессов, а, во-вторых, к снижению пролиферативной способности лимфоцитов.

Учитывая, высокую значимость метаболических реакций для функциональной активности лимфоцитов, основного структурно-функционального элемента иммунной системы, вероятно, полученные нами данные необходимо учитывать при разработке иммунокорригирующих мероприятий у детей с гипертрофией глоточной миндалины.

Список литературы / References

1. Савченко А.А., Сунцова Л.И. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. 1989. № 11. С. 23-25. [Savchenko A.A., Suntsova L.I. VysokochuvstviteFnoe opredelenie aktivnosti degidrogenaz v limfotsitakh perifericheskoy krovi biolyuminestsentnym metodom [Highly sensitive determination of dehydrogenase activity in peripheral blood lymphocytes by bioluminescent method]. Laboratornoe delo = Laboratory Science, 1989, no. 11, pp. 23-25.]

2. Терскова Н.В., Николаева А.И., Вахрушев С.Г., Смбатян А.С. Загрязнение атмосферного воздуха как фактор риска гипертрофии глоточной миндалины // Сибирское медицинское обозрение. 2013. № 5. С. 59-64. [Terskova N.V., Nikolaeva A.I., Vakhrushev S.G., Smbatyan A.S. Zagryaznenie atmosfernogo

Куртасова Л.М., Шмидт А.Р., Лубнина Т.В. KurtasovaL.M., ShmidtA.R., Lubnina T.V.

Медицинская Иммунология Meditsinskaya Immunologiya/Medical Immunology

vozdukha kak faktor riska gipertrofii glotochnoy mindaliny [Air pollution as a risk factor of pharyngeal tonsils enlargement]. Sibirskoe meditsinskoe obozrenie = Siberian medical review, 2013, no. 5, рр. 59-64.]

3. Abbrescia D.I., La Piana G., Lofrumento N.E. Malate-aspartate shuttle and exogenous NADH / cytochrome electron transport pathway as two independent cytosolic reducing equivalent transfer systems. Arch. Biochem. Biophys., 2012, Vol. 518, no. 2, pp. 157-163.

4. Boym A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, Vol. 21, no. 97, pp. 77-80.

5. De la Roche M., Tessier S.N., Storey K.B. Structural and functional properties of glycerol-3-phosphate degydrogenase from a mammalian hibernator. Protein J., 2012, Vol. 31, no. 2, pp. 109-119.

6. Hsich S.Y., Chen S.H., Hung H.C. Functional roles of the tetramer organization of malic enzyme. J. Biol. Chem., 2009, no. 27, pp. 18096-18105.

7. Lu M., Banerjee S., Saidel G.M., Yu X. Regulation of cytosolic and mitochondrial oxidation via malate-aspartate shuttle: an observation using dynamic 13C NMR spectroscopy. Adv. Exp. Med. Biol., 2011, Vol. 701, pp. 185-192.

8. Norris M.G., Malys N. What is the true enzyme kinetics in the biological system? An investigation of macromolecular crowding effect upon enzyme kinetics of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2011, Vol. 405, no. 3, pp. 388-392.

9. Pallardo F.V, Markovic J., Garcia-Gimenez J.L., Vina J. Role of nuclear glutathione as a key regulator of cell proliferation. Mol. Aspects Med., 2009, Vol. 30, no. 1, pp. 77-85.

10. Stanton R.C. Glucose-6-phosphate dehydrogenase, NADPH, and cell survival. IUBMB Life, 2012, Vol. 64, no. 5, pp. 362-369.

11. Tandogan B., Sengezer C., Ulusu N.N. In vitro effects of imatinib on glucose-6-phosphate degydrogenase and glutathione reductase. Folia Biol. (Praha), 2011, Vol. 57, no. 2, pp. 57-64.

NAD(P)-DEPENDENT DEHYDROGENASE ACTIVITY IN PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES OF INFANTS WITH ENLARGEMENT OF PHARYNGEAL TONSILS

Kurtasova L.M.a, Shmidt A.R.b, Lubnina T.V.b

a Krasnoyarsk V.F. Voyno-Yasenetsky State Medical University of the Ministry of Health Care of Russian Federation, Krasnoyarsk, Russian Federation

b Krasnoyarsk Regional Centre of Preventive Care and Control of Aids, Krasnoyarsk, Russian Federation

Abstract. We have observed and examined 57 children 1 to 3 years old diagnosed with enlargement of pharyngeal tonsils. A control group was presented by 35 healthy children. Bioluminescence technique was applied for studying NAD(P)-dependent dehydrogenase activity in peripheral blood lymphocytes. Activation of aerobic respiration and increasing activity of pentose phosphate cycle-dependent plastic processes were registered in blood lymphocytes of children with hypertrophic pharyngeal tonsils; along with decreased function of malate-aspartate shunt in energy metabolism of the cells, diminished anaerobic reaction of NADH-dependent LDH, lower interaction between Krebs cycle and reactions of amino acid metabolism, and reduced activity of glutathione reductase. (Med. Immunol., 2014, vol. 16, N 4, pp 381-384) Keywords: lymphocytes, enzymes, pharyngeal tonsil enlargement

Authors:

Kurtasova L.M., PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Clinical Immunology, Krasnoyarsk VE Voino-Yasenetsky State Medical University, Russian Ministry of Health Care, Krasnoyarsk, Russian Federation Shmidt A.R., Pediatrician, Krasnoyarsk Regional Centre of Preventive Care and Control of AIDS, Russian Federation Lubnina T.V., Pediatrician, Krasnoyarsk Regional Centre of Preventive Care and Control of AIDS, Krasnoyarsk, Russian Federation

Address for correspondence:

Kurtasova Lyudmila M

PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Clinical Immunology, Krasnoyarsk VF. Voino-Yasenetsky State Medical University, Russian Ministry of Health Care

660022, Russian Federation, Krasnoyarsk, Partizan Zheleznyak str., 1.

Phone: 7 (391) 220-06-28.

Fax: 7 (391) 221-16-38.

E-mail: [email protected]

Meditsinskaya Immunologiya/ Medical Immunology 2014, Vol. 16, No 4, pp. 381-384

SHORT COMMUNICATIONS

Received 21.02.2014

Accepted 26.03.2014