CC BY
56
РАЗНОЕ
УДК 612.014.1:616-006:577.15
АКТИВНОСТЬ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ У МЫШЕЙ ПРИ РАЗВИТИИ И МЕТАСТАЗИРОВАНИИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС
Яна Анатольевна КИСАРОВА
НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Исследована активность матриксных металлопротеаз (ММП) в присутствии и без специфического ингибитора сериновых протеаз фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ, 0,5 мМ) как показателя опухолевого роста и мета-стазирования у мышей с аденокарциномой легких Льюис (АЛЛ). Развитие опухоли на 16 сутки после перевивки характеризовалось более низкой активностью ММП-2,7 в ткани опухоли при использовании ФМСФ по сравнению с тканью легких интактных мышей. Показано, что у интактных животных в присутствии ФМСФ активность ММП-2,7 в ткани легкого выше, чем в селезенке и печени. Обнаружено, что процесс метастазирования в легкие сопровождался повышением активности ММП-2,7 в ткани легких по сравнению с соответствующими показателями интактных животных. В отсутствие ингибитора сериновых протеаз ФМСФ получены данные, указывающие на аналогичную тенденцию вышеуказанных изменений активности ММП-2,7 как у интактных животных, так и у мышей с АЛЛ. Полученные данные подтвердили гипотезу о вкладе ММП-2,7 в процессы развития опухоли и метастазирования АЛЛ мышей.
Ключевые слова: матриксные металлопротеазы, опухоль, метастазирование, аденокарцинома легких Льюис.
Повышение экспрессии различных классов ММП связывают с ростом и метастазированием опухолей [1, 2]. Согласно гипотезе Nagase й а1., ММП участвуют в деградации компонентов межклеточного матрикса [3], тем самым способствуя инвазии опухолевых клеток в окружающие здоровые ткани и дальнейшему проникновению в сосудистое русло.
ММП-2 (желатиназа А) с молекулярной массой 72 кДа, обнаруженная в эпителиальных клетках различных органов и тканей, способна гидролизовать денатурированные коллагены, желатин, а также белки соединительно-тканного матрикса [4]. Многочисленные исследования показывают, что усиление продукции фермента опухолевыми клетками обеспечивает их инвазивный потенциал [1]. Тог^ е1 а1. выявили, что уровень экспрессии ММП-2 в клетках аденокарциномы яичников положительно коррелирует с прогрессированием стадии опухолевого процесса и более высоким риском развития рецидивов у людей [5]. В отдельных работах ММП-2 рассматривают как маркер раннего рецидива рака у пациентов с карциномой головы и шеи при отсутствии метастазов в лимфатических узлах [6]. Обнаружено, что способность опухолевых клеток к инвазии увеличивается экспрессией ЯНоС (гена, способствующего метастазированию), что соответствует увеличен -ной активности ММП-2 [7].
ММП-7 (матрилизин 1) — относительно небольшой белок с молекулярной массой около
28 кДа, помимо компонентов внеклеточного матрикса разрушает молекулы клеточной поверхности, такие как про-а-дефензин, Fas-лиганд, про-TNF-а и Е-кадгерин [4]. ММП-7 экспрессируется в эпителиальных клетках гландулярных структур различных органов (молочной железы, печени, простаты, бронхов и др.) у здоровых людей, а также у пациентов с эпителиальными опухолями желудочно-кишечного тракта, простаты и молочной железы [2]. ММП-7 — основной фермент, продуцируемый клетками аденокарциномы пищевода, и его увеличенная экспрессия положительно коррелирует с гистологической агрессивностью опухоли; этот показатель рекомендуют определять как возможный прогностический маркер прогрессии пищеводной аденокарциномы Барретта у людей [8]. Исследования на различных моделях опухолей у мышей обнаружили повышенную экспрессию и активность мМп-2, ММП-7 и МмП-9 при развитии опухолевых процессов [1, 9]. Однако остается неясной роль изменения активности различных типов ММП в процессах метастазирова-ния на моделях in vivo.
Цель работы — изучить изменения активности ММП-2,7 у мышей при развитии АЛЛ, метастази-рующей в легкие.
Материал и методы
Использовали половозрелых мышей самцов линии С57В1/6 массой 20—27 г (виварий Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). Содержание, уход за животными и выведение их
Кисарова Я.А. — аспирант лаборатории клеточной биохимии и физиологии, e-mail: [email protected] 154 БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 4, 2010 г.
из эксперимента осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977). Животных содержали по 6-7 особей в клетке при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (гранулированный комбикорм ПК 120-1 ООО «Лабораторснаб», г. Москва) для лабораторных крыс и мышей, сбалансированный по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам. Исследование проводили согласно рекомендациям Этического комитета НИИ физиологии СО РАМН о гуманном обращении с животными.
Использовали перевиваемую опухоль мышей — аденокарциному легких Льюис, которая метаста-зирует в легкие [10, 11]. Опухолевые клетки перевивали в мышцы бедра в количестве (0,5—1,0) х 106 на мышь. Забой животных осуществляли декапи-тацией на 16-е сутки после трансплантации, когда отмечен рост опухоли и развитие метастазов. Опухоль была значительных размеров (4,99 ± 0,34 г) при минимальном количестве некротических процессов. Определяли массу легких (орган, из которого произошла опухоль АЛЛ), селезенки, печени и опухоли. Сыворотку получали при центрифугировании образцов крови при 3000 g в течение 20 минут (центрифуга «Eppendorf 5415 R», Германия). Все процедуры приготовления гомогенатов проводили на холоде (0...+4 °С), как указано ранее [12]. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури и соавторов [13]. Для определения активности ММП пробы обрабатывали 1:1 тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,1 % в течение 30 минут на холоде (концентрация белка в пробах 8—12 мг/мл).
Активность ММП в гомогенатах легких, селезенки, печени, опухоли и в сыворотке крови определяли при pH 7,5, используя флуоресцентный субстрат MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 (МКА, «American Peptide Company, Inc.», США), где MCA — 7-метоксикумарин-4-ацетил, Dpa — N-3-(2,4-динитрофенил)^- а, ß - диаминопропионил — гаситель флуоресценции [14]. С помощью данного субстрата определяется активность ММП-2,7, а согласно данным современного протеомного анализа — и других типов ММП, расщепляющих связи Gly~Leu [12]. Реакцию останавливали добавлением охлажденного 50 мкМ раствора ЭДТА. Флуоресценцию оценивали с помощью спектро-флуориметра «Shimadzu RF-5301 PC» (Япония) при длине волн возбуждения и эмиссии соответственно 328 и 393 нм. В качестве стандарта использовали 7-метилкумарин (MP «Biomedicals Inc.», США).
Для исключения вклада сериновых протеаз в расщепление субстрата в отдельных пробах параллельно проводили определение активности ММП в присутствии их специфического ингибитора фе-
нилметилсульфонилфторида (ФМСФ, «ВоеИп^ег МаппИет», Германия) в концентрации 0,5 ммоль/л. Пробы инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 °С в присутствии и в отсутствие ФМСФ. Активность ММП в гомогенатах ткани выражали в мкмоль МКА/мин на 1 г белка, в сыворотке крови — в мкмоль МКА/(л х мин).
Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью пакета «^а^юа 6.0.» Форму распределения оценивали критерием Колмогорова — Смирнова, значимость различий средних — однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) и 1-критерием Стьюдента. Результаты представлены в виде М ± т, где М — среднее арифметическое значение, т — ошибка среднего. Уровень значимости а принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Развитие опухоли сопровождалось увеличением относительной массы печени, селезенки и легких, что, возможно, обусловлено развитием метастазов опухоли в этих органах (рис. 1).
В настоящей работе нами впервые была изучена активность ММП-2,7 в присутствии специфического ингибитора сериновых протеаз ФМСФ. При добавлении ФМСФ скорость гидролиза субстрата была снижена на 21,3 % в легких интакт-ных мышей и мышей с АЛЛ, на 39,8 % — в печени интактных животных и на 32 % — в печени опухоленосителей, на 18 и 21 % соответственно — в селезенке, на 39,2 % — в ткани опухоли, на 62 и 57,2 % соответственно — в сыворотке крови. Судя по тому, что ингибитор снижал ферментативную активность в разных органах в разной степени, вклад сериновых протеаз в деградацию используемого субстрата являлся довольно существенным.
При изучении активности ММП-2,7 в присутствии ФМСФ у интактных мышей была обнаружена наиболее высокая активность ММП-2,7 в лег-
оЗ
а з-
Селезенка Легкие Печень
Рис. 1. Относительная масса органов интактных
мышей (■) и мышей с АЛЛ (ш) (* — р < 0,01 по сравнению с интактными животными)
Таблица
Сравнительная характеристика активности ММП-2,7 в гомогенатах легких, селезенки, печени, опухоли и в сыворотке крови у интактных мышей и мышей с АЛЛ
Исследованные образцы Интактные (п = 12) АЛЛ (п = 14)
в отсутствие ФМСФ в присутствии ФМСФ в отсутствие ФМСФ в присутствии ФМСФ
1. Легкие 0,188 ± 0,012 0,148 ± 0,011 0,286 ± 0,027* 0,225 ± 0,015++
2. Селезенка 0,067 ± 0,012 р1-2 < 0,01 0,055 ± 0,009 р1-2 < 0,01 0,124 ± 0,008* р1-2 < 0,01 0,098 ± 0,012+ р1-2 < 0,01
3. Печень 0,098 ± 0,009 р1-3 < 0,01 р2-3 < 0,05 0,059 ± 0,004 р1-3 < 0,01 р2-3 > 0,05 0,109 ± 0,009 р1-3 < 0,01 р2-3 < 0,01 0,074 ± 0,008 р1-3 < 0,01 р2-3 < 0,01
4. Опухоль - - 0,097 ± 0,006 р1-4 < 0,01 р2-4 < 0,01 р3-4 < 0,01 0,059 ± 0,005# р1-4 < 0,01 р2-4 < 0,01 р3-4 < 0,01
5. Сыворотка 2,106 ± 0,077 0,800 ± 0,031 0,767 ± 0,067* 0,328 ± 0,035++
Примечание: активность ММП в гомогенатах тканей выражена в мкмоль МКА/мин на 1 г белка, в сыворотке крови — в мкмоль МКА/(л х мин); * — р < 0,01 по сравнению с интактными животными в отсутствие ФМСФ;
+ — р < 0,05, ++ — р < 0,01 по сравнению с интактными животными в присутствии ФМСФ; # — р < 0,01 по сравнению с легкими интактных животных в присутствии ФМСФ.
ких по сравнению с селезенкой и печенью (табл.). У мышей с опухолью активность ММП-2,7 также была максимальной в легких и менее выражена в селезенке и печени.
В ткани легких мышей с опухолью активность ММП-2,7 выше, чем в легких интактных животных, что, возможно, обусловлено развитием метастазов (табл.). Опухоленосительство сопровождалось повышением активности ММП-2,7 в селезенке, в печени изменений не выявлено.
Активность ММП-2,7 в присутствии ингибитора ФМСФ в ткани опухоли оказалась ниже, чем в легких, селезенке и печени у мышей с АЛЛ
141
12-
І-Ч
ю
§ 104
3 & к
<а
и &
8-
т
Селезенка Легкие Печень
Рис. 2. Концентрация белка в гомогенатах органов интактных мышей (ш) и мышей с АЛЛ (ш)
(табл.). При сравнении ткани опухоли с органами интактных животных обнаружено, что активность ММП-2,7 в ней значимо ниже, чем в ткани легких.
В сыворотке крови мышей с АЛЛ в присутствии ФМСФ активность ММП-2,7 значимо ниже, чем в сыворотке интактных животных, что, возможно, отражает повышенное содержание эндогенных ингибиторов ММП (тканевый ингибитор метал-лопротеазы 1, ТИМП-1 и др.), обладающих плей-отропным (проопухолевым) эффектом (табл.).
В отсутствие ингибитора сериновых протеаз ФМСФ получены данные, указывающие на аналогичную тенденцию вышеуказанных изменений активности ММП-2,7 как у интактных животных, так и у мышей с АЛЛ (табл.).
Выявлено, что концентрации белка в легких, печени и селезенке интактных животных, а также мышей с АЛЛ не различались (рис. 2), что позволяет говорить об абсолютных изменениях активности ММП при расчете удельной активности фермента (в пересчете на 1 мг белка).
Таким образом, можно сделать заключение, что увеличение активности ММП-2,7 характерно для метастазирования АЛЛ мышей, в то время как активность ММП-2,7 в ткани опухоли ниже, чем в легких и других органах опухоленосителей. Эти изменения могут быть обусловлены преобладанием не имеющих ферментативной активности проформ ММП-2,7 в опухолевой ткани и повышением активных форм ММП-2,7 в ткани легких при метастазировании.
Известно, что активность ММП регулируется специфическими тканевыми ингибиторами — ТИМП-1, -2, -3, -4 [6], и поэтому соотношение ММП и их эндогенных ингибиторов (ТИМП) является значимым фактором в действии металлопротеаз. Можно предположить, что повышенная активность ММП в легких при метастазировании в нашей работе может быть также связана с изменениями соотношения ММП/ТИМП в сторону преобладания ММП. Однако роль данных факторов требует дальнейшего изучения.
Благодарности
Выражаю признательность научному руководителю данной работы — заведующей лабораторией клеточной биохимии и физиологии НИИ физиологии СО РАМН, доктору медицинских наук, профессору Татьяне Александровне Короленко, а также благодарность ведущему научному сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН, кандидату биологических наук Василию Ивановичу Каледину за помощь при работе с животными с аденокарциномой легких Льюис.
Список литературы
1. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л. Матриксные металлопротезаы в онкогенезе // Сиб. онкол. журн. 2003. (2). 62—70.
Klisho E.V., Kondakova I.V., Choinzonov E.L. Matrix metalloproteases in oncogenesis // Sib. oncol. zhurn. 2003. (2). 62-70.
2. Vihinen P., Ala-aho R., Kahari V.-M. Matrix metalloproteases as therapeutic targets in cancer // Curr. Cancer Drug Targets. 2005. 5. 203-220.
3. Nagase H, Woessner J.F. Jr. Matrix metallopro-teinases // J. Biol. Chem. 1999. 274. 21491-21494.
4. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function and biochemistry // Circ. Res. 2003. 92. 827-839.
5. Torng P.L., Mao T.L., Chan W.Y. et al. Prognostic significance of stromal metalloproteinase-2 in ovarian adenocarcinoma and its relation to carcinoma progression // Gynecol. Oncol. 2004. 92. 559-567.
6. Ondruschka C., Buhtz P., Motsch C. et al. Prognostic value of MMP-2, -9 and TIMP-1, -2 immuno-reactive protein at the invasive front in advanced head
and neck squamous cell carcinomas // Pathol. Res. Pract. 2002. 198. (8). 509-515.
7. Ikoma T., Takahashi T., Nagano S. et al. A definitive role of RhoC in metastasis of orthotopic lung cancer in mice // Clin. Cancer Res. 2004. 10. 1192— 1200.
8. Simian M., Hirai Y., Navre M. et al. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells // Development. 2001. 128. (16). 3117-3131.
9. Diaz R.J., Eichten A., Karin E. de V., Cous-sens L.M. Matrix metalloproteinases: mediators of tumour-host cell // Integr. Interact. Oncol. Growth. 2005. 6. 81-126.
10. Жанаева С.Я., Алексеенко Т.В., Короленко Т.А. Влияние хлорида гадолиния на рост и ме-тастазирование аденокарциномы легких Льюис у мышей // Бюл. экспер. биол. мед. 2008. 146. (11). 548-551.
Zhanaeva S.Ya., Alexeenko T.V., Korolenko T.A. Influence of gadolinium chloride on growth and me-tastasing of Lewis lung carcinoma in mice // Bul. exper. biol. med. 2008. 146. (11). 548-551.
11. Zhanaeva S.Ja., Falameeva O.V., Filatova T.G. Effect of different biological response modifiers on growth and metastasing of murine Lewis lung adenocarcinoma // Int. J. Immunotherapy. 2003. XIX. (2-4). 141-150.
12. Беличенко В.М., Короленко Т.А., Жанаева С.Я., Шошенко К.А. Активность матриксных металлопротеиназ в скелетных мышцах куриных эмбрионов разного возраста // Журн. эволюц. биохимии физиол. 2009. 45. (3). 343-345.
Belichenko V.M., Korolenko T.A., Zhanaeva S. Ya, Shoshenko K.A. Activity of matrix metalloproteinases in skeletal muscle of chick embryos of different ages // Zhurn. evolyuts. biokhimii fiziol. 2009. 45. (3). 343345.
13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. 193. 265-275.
14. Knight C.G., Willenbrock F., Murphy G. A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases // FEBS Lett. 1992. 296. 263-266.
MATRIX METALLOPROTEASES ACTIVITY IN MICE WITH LEWIS LUNG ADENOCARCINOMA GROWING AND METASTASING INTO LUNG
Yana Anatoljevna KISAROVA
Institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
The activity of matrix metalloproteases (MMP) was studied in tumor tissue of mice with Lewis lung adenocarcinoma during tumor growing and metastasing into lung in the presence of the inhibitor of serine proteases (PMSF, 0,5 mM) and without it. Tumor growing was followed by decreased MMP-2,7 activity in tumor tissue in comparison with this index in lung of intact mice at 16th day after tumor transplantation. In intact mice MMP-2,7 activity is higher in lung tissue than in spleen and hepar in presence of PMSF. It has been revealed that metastasing process was characterized by increased MMP-2,7 activity in lung as compared to the obtained results in lung of intact mice. The data obtained without PMSF showed similar tendency to above-stated changes of MMP-2,7 activity in intact animals as well as in mice with tumor. The data obtained confirm the hypothesis on the important role of MMP-2,7 both in tumor growth and metastasis.
Key words: matrix metalloproteases, tumor, metastasis, Lewis lung adenocarcinoma.
Kisarova Y.A. — post-graduate student of the laboratory for cellular biochemistry and physiology, e-mail: [email protected]
