CC BY
78
УДК 616.345-006.66:578.245.2:575.113 Т.М. Соколова1,2, Е.Н. Кособокова3, А.Н. Шувалов1, И.М. Шаповал1, В. С. Косоруков3, Ф.И. Ершов1 АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ИНТЕРФЕРОНА В КЛЕТКАХ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА НСТ-116: РЕГУЛЯЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫМИ ИНТЕРФЕРОНАМИ-АЛЬФА-2 ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ 1ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ, Москва 2ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» МЗ РФ, Москва 3ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Соколова Татьяна Михайловна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзимологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ и лаборатории интерфероногенеза НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи МЗ РФ
адрес: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16; тел. +7(499)516-5804 e-mail: tmsokolovavir@mail.ru
Статья поступила 02.04.2013, принята к печати 09.07.2013.
Резюме
Широкий спектр действия ИФН обеспечил их активное применение в качестве противовирусного и антибактериального средства. Однако использование этих цитокинов в онкологии ограничено определенными формами рака. Во многом это объясняется недостаточностью знаний о механизме действия разных типов ИФН в опухолевых клетках. Целью данной работы стало изучение активности генов системы ИФН в клетках адено-карциномы толстой кишки HCT-116 при помощи ОТ-ПЦР. Для сравнения использовали линию клеток фиброб-ластов легкого эмбриона человека ФЛЭЧ-977. В ходе работы проанализировали целый спектр генов, охватывающих основные биологические активности ИФН (антивирусную, антипролиферативную и иммуномодули-рующую). Сравнили 5 отечественных препаратов рекомбинантных ИФН-а-2Ь. Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки аденокарциномы толстого кишечника НСТ-116 характеризуются отсутствием экспрессии ряда генов системы ИФН (ИФН-ß-! ИФН -у, ИСГ-15) и сигнальных регуляторов апоптоза (Fas-рецептора и ИЛ6). В них снижены уровни активности генов семейства ИФН-а, но проявляется высокая конститутивная активность протоонкогена Bcl-2 и повышены уровни экспрессии генов ИФН-Х-1 и ИФН-зависимых ферментов (ОАС1, дсПк и РНКазы), ИЛ4 и ИЛ17. Позитивным свойством исследованных препаратов ИФН-а-2b является подавление экспрессии протоонкогена Bcl-2 и активация транскрипции генов ИФН-а, ИФН-Х и ИФН-зависимых ферментов в опухолевых клетках НСТ-116.
Ключевые слова: интерферон, опухолевые клетки, фибробласты, экспрессия генов, рекомбинантные
белки.
12 3 1 1 3 1
T.M. Sokolova ' , E.N. Kosobokova , A.N. Shuvalov , I.M. Shapoval, V.S. Kosorukov , F.I. Ershov
INTERFERON SYSTEM GENE ACTIVITY
IN COLON ADENOCARCINOMA CELLS HCT-116:
REGULATION BY INTERFERON-ALPHA-2B
FROM BACTERIA OR PLANTS
1FSBI «N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology», Moscow
2FSBI «D.I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Moscow
3FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
Broad activity spectrum of IFNs has assured its wide application as antiviral and antibacterial agent. However this cytokine is used for treatment of certain cancer types only. Mainly it is explained by lack of knowledge about IFN antitumor action mechanism. Hereafter we describe the study of IFN system gene activity in colon adenocarcinoma cells (HCT-116) using RT-PCR. Human lung embryo fibroblast (HLEF-977) was used for comparison. Multiple IFN system functional genes were analyzed. Five medicaments, produced in Russia, were compared with each other. Results show that the inherency of cancer HTC-116 cells is absence of expression of several apoptosis signal regulator and IFN system genes. The IFN-alpha family gene activity level is lower, but protooncogene Bcl-2 shows high activity and IFN-H®H-X-1, IFN-depended enzymes, IL4 and IL17 gene expression levels are higher in these cells. Positive feature of analyzed medicaments is suppressed protooncogene Bcl-2 expression and activated IFN- a, IFN- X-1 and IFN-depended enzymes gene transcription colon adenocarcinoma cells HCT-116.
Key words: interferon, cancer cell lines, fibroblasts, gene expression, recombinant proteins.
Введение
Антивирусные, антипролиферативные и им-муномодулирующие активности ИФН являются основой их терапевтического применения [1; 15]. Человеческие ИФН классифицированы в 3 типа (а/р -
I, у - II и X - III тип). ИФН действуют через специфические рецепторы на поверхности клеток и индуцируют сигнальные процессы, приводящие к активации многих ИФН-зависимых генов, в т.ч. и генов самих ИФН [22]. Наиболее изучены механизмы антивирусного и антипролиферативного действия
ИФН, связанные с участием генов, кодирующих ряд дсРНК-зависимых белков-ферментов (олигоадени-латсинтетазы/РНКазы L и протеинкиназы) [24]. Особый интерес представляет регуляция ИСГ 15. Он кодирует убиквитиноподобный белок, способный взаимодействовать и модифицировать клеточные сигнальные факторы NFkB, IRF3 и др. [21]. Белок ИСГ 15 секретируется клетками, проявляет цитоки-новую активность и влияет на развитие опухолей. Иммуномодулирующие свойства ИФН обусловлены активирующим действием на иммунокомпетентные клетки (дендритные, макрофаги, Т- и В-лимфо-циты). ИФН вызывает их пролиферацию, дифферен-цировку и продукцию ими цитокинов [17].
В 9-й хромосоме человека локализовано многочисленное семейство генов а-ИФН. Описано 13 экспрессируемых вариантов ИФН-а, их них а-2 и а-8 имеют наиболее высокую антивирусную активность [10]. Широкое применение в медицине получили препараты рекомбинантных ИФН-а-2Ь, которые являются универсальными средствами профилактики и лечения вирусных и бактериальный инфекций [2].
Применение ИФН в онкологии пока ограничено определёнными формами рака [4]. Во многом это объясняется недостаточностью знаний о механизмах действия разных видов ИФН в опухолевых клетках. Известно, что в клетках разных видов опухолей человека происходят существенные нарушения в регуляции активности клеточных генов. В генах ключевых эффекторов системы ИФН и апоп-тоза обнаружены мутации, что приводит к снижению их функциональной активности [12].
Проведенный в опухолевых клетках анализ генной экспрессии преимущественно охватывает протоонкогены, факторы апоптоза, ангиогенеза и пролиферации, и мало затрагивает гены системы ИФН. Для изучения молекулярных механизмов действия известных и вновь созданных отечественных препаратов ИФН в настоящей работе применен количественный ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов.
Проведено сравнение конститутивной и ИФН-индуцированной экспрессии генов в 2 линиях клеток: НСТ-116 (аденокарцинома толстой кишки) и ФЛЭЧ-977 (фибробласты легкого эмбриона человека). Опухолевые клетки НСТ-116, в отличие от ФЛЭЧ, малочувствительны к ИФН [11].
Проанализирована экспрессия генов 4 видов ИФН (а, ß-1, у, Х-1), 3 генов ИФН-зависимых ферментов (ОАС1-олигоаденилатсинтетазы, дсПК-дсРНК-зависимой протеинкиназы, РНКазы L), 2 генов регуляторов апоптоза (Fas-рецептора и про-тоонкогена Bcl-2) и 3 генов интерлейкинов, участвующих в иммунном ответе (ИЛ4, ИЛ6 и ИЛ17). Спектр выбранных генов во многом охватывает основные биологические активности присущие ИФН (антивирусную, антипролиферативную и им-мунорегуляторную).
Перед нами стояли 2 задачи:
1) выяснить особенности реакции генов опухолевых клеток аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 на ИФН-а-2;
2) сравнить действие 5 отечественных препаратов человеческих рекомбинантных ИФН-а-2Ь: 4 из них получены из бактериального продуцента (Esch. coli) и 1 -из растительного (Nicotiana benthamia-na). В рамках данной работы нами впервые показана способность представленных рекомбинантных ИФН индуцировать транскрипцию клеточных генов.
Материалы и методы Клетки
аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 и фибробласты лёгкого эмбриона человека ФЛЭЧ-977
Линия клеток аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 (colon adenocarcinoma cells, АТСС catalog No. CCL.-247) получена из банка опухолевых клеток ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10 %-ной ТЭС и антибиотиками. Фибробласты лёгкого эмбриона человека (линия ФЛЭЧ-977) приобретены в Медико-генетическом центре РАМН (Москва). ФЛЭЧ выращивали в питательной среде DMEM с 10 %-ной ТЭС и антибиотиками.
Препараты человеческих рекомбинантных ИФН-а Изучено 5 препаратов:
■ Реаферон - известный отечественный ИФН-а-2Ь (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), выпускаемый в ампулах с активностью 1 млн МЕ;
■ три оригинальных препарата ИФН-а-2Ь, синтезированные в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (два получены из бактериального продуцента E.coli, ИФН-a-2b-6His и ИФН-а-2Ь-12Н1Б [5], и один фитоИФН-а-2Ь-6Н1з, получен из растительного продуцента N. benthamiana (неопубликованные данные);
■ препарат ИФН-а-2а с активностью 2*108 МЕ/мл приобретён в ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург).
Противовирусная активность препаратов и реакция нейтрализации
Определяли на чувствительных к ИФН клетках ФЛЭЧ-977 микрометодом по подавлению ЦПД вируса ЭМК 100 доз ЦПД50. Клетки инкубировали с ИФН 24 ч при 37 °С, в 5 % СО2, затем ИФН удаляли, а клетки заражали вирусом. Результаты вирусного ЦПД учитывали в световом микроскопе. Ставили реакцию нейтрализации ИФН активности с моноклональными антителами (МКА PC/IF1 A001 и PC/IF3 A004) к рекомбинантному ИФН-а-2 (ООО «Протеиновый контур»). К высокоактивным препаратам ИФН-а-2 добавляли равный объём МКА, разведенных в 100 раз, и инкубировали смесь 1 ч при 37 °С. «Контроль 1» - те же препараты ИФН без добавления МКА (положительный) и «контроль 2» - МКА без добавления ИФН (отрицательный), инкубированные параллельно в тех же условиях.
Анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени Постановку опытов на обоих типах клеток осуществляли в 96-луночных планшетах. Эксперименты повторяли 2 раза. В лунки высевали клетки в концентрации 200-400 тыс./мл и через 48 ч, после образования клеточного монослоя, производили смену питательной среды на свежую. Затем вносили исследуемые препараты ИФН в дозе 500-10000 МЕ/мл на срок 24 ч при 37 °С. Контролем служили клетки необработанные ИФН. Клетки монослоя промывали 0,1 М фосфатным буфером pH 7, лизиро-вали реагентом Trizol (Invitrogen) по инструкции и замораживали -20 °С. Объединяли образцы 6 аналогичных лунок. Суммарное количество клеток со-
ставляло примерно 0,5-1 млн. Выделенную смесью тризол+хлороформ суммарную Pffi^, осаждали изо-пропанолом и обрабатывали ДНКазой (набор «DNAfree» Ambion) по инструкции. Суммарную кДНК получали в реакции обратной транскрипции (ОТ) с праймерами олиго^Т)15 или random (случайные). Все использованные в реакции ОТ реактивы (фермент MMuLV, RNAsin, 4 вида dNTP) были производства фирмы «Promega», США. В количественной ОТ-П^ анализировали разведения кДНК 1/5 и 1/50 в зависимости от выявляемых конститутивных уровней транскрипции генов. Смешивали кДНК со специфическими парами праймеров и готовой 2-кратной смесью SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad, США). Структура праймеров на консервативные участки i^PM; ИфН-a (подвиды 4; 7; 8 и 21), ферментов олигоаденилатсинтетазы (ОАС1) и дсPHК-протеинкиназы (дсПК), Fas-рецептора и протоонко-гена Bcl-2 опубликованы нами ранее [6; 7]. Дополнительно в программах «Primer Express» и «Primer 3 blast» были рассчитаны новые пары праймеров к мPHК ИФН-3-1, ИФН-y, ИФН-Х-1, ИФН-стимули-руемого гена (ИСГ)15, PHКaзы L и ИЛ6 (табл. 1). Праймеры к мPHК ИЛ4, ИЛ17 и рибосомальной 18S описаны в литературе [16; 23; 25].
П^ ставили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США) в режиме реального времени. Протокол ПЦ?: 96 °С 2 мин, далее 45 циклов 94 °С 10 сек, 50-54 °С 20 сек, 72 °С 30 сек. Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы синтеза регистрировали по нарастанию флюоресцентного сигнала интер-калирующего в ДНК красителя EvaGreen.
Анализ экспрессии генов выполняли с помощью программы «Gene Expression analysis CFX-96» двумя способами:
1) 5Cq - относительно контроля принятого за 1 (оценка действия препаратов ИФН)
2) нормализуя уровни на референс 18S ри-босомальную PHК (сравнение конститутивных уровней экспрессии в двцх типах клеток) [20].
В конечной точке KUP по температурным пикам плавления устанавливали специфичность ДНК-продуктов и анализировали их электрофорезом в агарозном геле на соответствие расчётным размерам. Негативный контроль (без кДНК) не давал специфических амплификатов. Эффективность амплификации (Е) оценивали в разведениях кДНК по калибровочной кривой (величина Е составляла 90-100 %).
Результаты и обсуждение
Противовирусная активность
и антигенная специфичность
препаратов ИФН-а-2 бактериального
и растительного происхождения
В табл. 2 приведены данные экспериментов по определению противовирусной активности исследованных рекомбинантных ИФН^-2 в культуре фибробластов лёгкого эмбриона человека ФЛЭЧ-977. Использовали стандартный микрометод, основанный на эффекте подавления ЦПД вируса ЭМК в чувствительной к ИФН клеточной культуре. Все исследованные препараты рекомбинантных ИФН-a-2 в клетках ФЛЭЧ сохраняли достаточно высокую биологическую активность в процессе хранения при 10 °С (1 мес.) и способность взаимодействовать с МКА А001. Pазновидности a^ и a-2b ИФН не отличалось по уровню нейтрализации МКА. Бактериальные ИФH-a-2b-6His и ИФH-a-2b-12His и растительный фитоИФH-a-2b-6His, имеющие конформа-
ционные отличия в структуре белка за счет наличия аффинного домена, также показали высокий уровень нейтрализации с этим МКА (табл. 2).
По-видимому, все препараты имеют близкую антигенную специфичность и общий антигенный сайт взаимодействия с МКА А001, совпадающий или перекрывающийся с участком белковой последовательности, отвечающим за проявление биологической активности. При добавлении к исследованным вариантам ИФН-а-2 другого МКА А004 нейтрализующего эффекта на противовирусную активность не выявлено вследствие иной локализации антигенного сайта.
Экспрессия генов в клетках аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 и фибробластах
лёгкого эмбриона человека ФЛЭЧ-977 ИФН регулируют экспрессию нескольких сотен клеточных генов, среди которых значительное место занимают гены системы ИФН, апоптоза и клеточной пролиферации [14]. Транскрипционные программы геномов разных типов клеток имеют характерные особенности. Большой интерес представляют опухолевые клетки с нарушенными процессами регуляции пролиферации и дифференцировки, малочувствительные или резистентные к цитостатикам и препаратам ИФН. К таким относятся клетки аденокарциномы толстой кишки НСТ-116. Ранее с использованием технологии ДНК-чипов в них был сделан анализ генной экспрессии до и после обработки полиамин-ным препаратом [18]. Однако анализ не включал ключевые ИФН-зависимые гены. Нами впервые изучены гены, регулируемые отечественными препаратами рекомбинантных ИФН-а-2, что является важным для возможности их клинического использования в онкологии. В ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, применяя современные технологии синтеза генов человеческих рекомбинантных белков, получены препараты ИФН-а-2 с конформацией свойственной человеческим белкам [5].
Конститутивные уровни экспрессии клеточных генов Результаты, представленные в табл. 3, дают оценку конститутивных уровней мРНК в опухолевых клетках аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 по сравнению с нормальными фибробластами лёгкого эмбриона ФЛЭЧ (без обработки ИФН). Постановка экспериментов в двух типах клеток осуществлялась в одинаковых условиях с одними препаратами ИФН-а-2. Поэтому мы сочли возможным сравнить конститутивные уровни экспрессии генов в клетках аденокарцино-мы и в нормальных фибробластах по пороговым циклам амплификации (Сф, различиям 5&[ относительно 188 рибосомальной РНК в каждом типе клеток и, используя 188 рибосомальную РНК как референс-нормализатор, оценить измененную экспрессию генов в клетках аденокарциномы НСТ по сравнению с фибробластами ФЛЭЧ (2 в степени 55Сф. Такой вариант анализа позволяет, сопоставить экспрессию меняющихся генов относительно стабильного референс-гена. Клеткам аденокарциномы НСТ-116 присуща высокая конститутивная экспрессия протоонкогена Вс1-2, в 2000 раз превышающая уровень нормальных фиброб-ластов ФЛЭЧ. Опухолевые клетки, в отличие от фиб-робластов лёгкого, характеризуются невыявляемыми уровнями транскрипции мРНК ИФН-0-1, ИСГ15, Ба8-рецептора, ИЛ6 (рис. 1), а также сниженным содержанием мРНК ИФН-а.
Таблица 1
Структура ПЦР-праймеров
Название ген/мРНК Прямой праймер Обратный праймер
ИФН-у* 5' atgaaatatacaagttatatcttgg 5 'ttactgggatgctcttcg
ИФН-в-1* 5' atgaccaacaagtgtctc 5 'tcagtttcggaggtaacc
ИФН-Х-1** 5' catcatcttggattgcccattt 5 'tatttg^gtetegdgtagg
ИСГ-15* 5' atgttttcagataattcacattgc 5' ctatttgttttggcccagttt
РНК-аза L** 5'atggagccacaggggcca 5'aggaccagccgtccaaggtcc
ИЛ 6* 5 'atgaactccttcacaa 5 'ctacatttgccgaagagc
Праймеры рассчитаны в программах *Primer Express и **Primer3 Blast. Структура других использованных праймеров опубликована ранее [6; 7] и взята из литературы [16; 23; 25].
Таблица 2
Противовирусная активность и антигенная специфичность препаратов ИФН-а-2
Препарат Производитель, продуцент Активность МЕ/мл Нейтрализация активности МКА МЕ/мл (%)
Реаферон ИФН-а-2Ь ГНЦ ВБ «Вектор» Б.соИ 2х10э 103(95)
ИФН-а-2b-6His РОНЦ Б.соИ 1,6х10э 104(94)
ИФН-а-2b-12His РОНЦ Б.соИ 105 2х104 (80)
фитоИФН-а-2b-6His РОНЦ растение КЬепШатапа 6х104 4х103 (93,4)
ИФН-а-2a ООО «Протеиновый контур» Б.соИ 108 3х106 (97)
Таблица 3
Сравнение конститутивных уровней экспрессии генов в клетках аденокарциномы толстого кишки НСТ-116 и фибробластах лёгкого эмбриона человека ФЛЭЧ-977__
мРНК (кДНК) Cq (5Cq) Экспрессия генов в клеточных линиях Нормализованная экспрессия в клетках НСТ 25Cq Кратность измененной экспрессии в клетках НСТ-116 2 в степени 5Cq
ФЛЭЧ НСТ-116
18S риб.РНК 20 28 **
ИФН- а 27(-7) 37(-9) - 2 Ниже в 4 раза
ИФН- в-1 32(-12) >45* Не выявляется
ИФН- Х-1 35(-15) 40 (-12) + 3 Выше в 8 раз
ИФН- у >45* >45* Не выявляется
ОАС1 34(-14) 38(-10) + 4 Выше в 16 раз
Дс-ПК 28(-8) 35(-7) + 1 Выше в 2 раза
РНКаза L 29(-9) 35(-7) + 2 Выше в 4 раза
ИСГ15 27(-7) >45* Не выявляется
FAS(CD95) 30(-10) >45* Не выявляется
BCL-2 28(-8) 25(+3) + 11 Выше в 2048 раз
ИЛ4 29(-9) 33(-5) +4 Выше в 16 раз
ИЛ6 41(-21) >45* Не выявляется
ИЛ17 30(-10) 35(-7) + 3 Выше в 8 раз
Сq -пороговые циклы амплификации (в скобках разница 5Сq с рибосомальной РНК). *Невыявляемая экспрессия генов после проведения 45 циклов амплификации. **188 РНК референс-нормализатор уровней исследованных мРНК. Расчёты выполнены по формуле 5Cq=CqрибРНК- CqмРНК в каждом типе клеток. 25Cq = 5CqHCT-5CqФЛЭЧ. Кратность 2 в степени 2 5Cq.
Изменения в экспрессии этих генов объясняет причину дефектной реакции этих раковых клеток на препараты ИФН и индукторы апоптоза.
Вместе с тем, в клетках аденокарциномы повышены уровни мРНК ИФН-Х-1, ИФН-зависимых ферментов (ОАС, дсПК и РНКазы).
Возможно, активация группы антивирусных генов в опухолевых клетках, является способом защиты их от внешних неблагоприятных воздействий патогенов.
В клетках аденокарциномы вирус ЭМК не вызывал цитопатогенного действия. Опухолевые клетки характеризуются более высокими конститутивными уровнями мРНК ИЛ4 и мРНК ИЛ17. Следует отметить, что в фибробластах человека происходила индукция 2 транскриптов гена ИЛ4, а в раковых - только одного из них, хотя и на более высоком уровне (рис. 1).
Действие препаратов ИФН-а-2 на экспрессию клеточных генов Между действием препаратов в двух линиях клеток обнаружены определенные отличия, хотя в ряде случаев на одном типе клеток у разных препаратов выявляются общие закономерности (табл. 4).
В клетках аденокарциномы толстой кишки (НСТ-116), в отличие от фибробластов лёгкого эмбриона (ФЛЭЧ-977), исследованные препараты ИФН-а-2 не индуцировали транскрипцию генов ИФН-0-1, ИФН-у, ИСГ-15 и РаБ-рецептора (табл. 4, рис. 1).
Вместе с тем препараты стимулировали гены ИФН-а и ИЛ4 в клетках аденокарциномы. При этом более сильным активатором гена ИФН-а был бактериальный ИФН-а-2Ъ-6ШБ. Реаферон, чИФН-а-2а и растительный фитоИФН-а-2Ъ-6ШБ повышали в опухолевых клетках транскрипцию мРНК ИФН-Х-1.
Таблица 4
Действие рекомбинантных альфа-2-ИФН на экспрессию генов системы ИФН в клетках НСТ-116 и ФЛЭЧ-977
Препараты а2-ИФН Клетки ИФН-а ИФН-01 ИФН- у ИФН-Х1 ОАС РНКаза дсПК
Реаферон ИФН-а-2Ь НСТ ФЛЭЧ 6 т 1 0 28Т 0 3 7Т 2 6Т 2 1 4 3 2
ИФН-а-2Ь-6Н1Б НСТ ФЛЭЧ 14Т 0,4 0 8Т 0 3 0 1 3 1 1 0,2 2 0,4
ИФН-а-2Ь-12Н1Б НСТ ФЛЭЧ 1 1 0 Ни 0 1 0 1 6Т 0,3 1 0,2 4 0
фитоИФН-а-2Ь-6Н1з РОНЦ НСТ ФЛЭЧ 8Т 1 0 2 0 0,1 4 0,1 8Т 0,4 4 1 3 1
ИФН-а-2а НСТ ФЛЭЧ 6Т 1 0 0,1 0 10Т 3 1 3 0,2 1 0,2 6Т 0,2
Числовые показатели - кратность относительно контроля принятого равным 1 (2 в степени 5Cq опыт - 5Cq контроль). | показаны наиболее значимые эффекты стимуляции. Ни - не исследован.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР. Клетки обработаны:
1 - Реаферон ИФН-а-2Ь,
2 - Бактериальный ИФН-а-2Ь-6Ш8,
3 - Контроль (необработанные ИФН).
Все препараты активировали ген дсПК в клетках аденокарциномы. Индукция экспрессии этого протеинкиназного гена, участвующего в апоптозных реакциях, по имеющимся данным, повышает чувствительность клеток рака молочной железы к цитостатическому действию химиопрепа-рата доксирубицин [9]. В обоих типах клеток отсутствует конститутивная экспрессия гена ИФН-у (табл. 3), но добавление к фибробластам человека препарата ИФН-а-2а вызывает его стимуляцию (табл. 4) . Подобного активирующего действия на ген ИФН-у в опухолевых клетках НСТ не наблюдается. Растительный ИФН сильнее других повышал транскрипцию мРНК ОАС1 и активировал ген РНКазы L в опухолевых клетках. Препараты ИФН-а-2Ь подавляли экспрессию гена Bcl-2 в опухолевых клетках HTC-116 (рис. 2, Б).
Максимальный ингибирующий эффект (более чем в 100 раз) показал рекомбинантный белок, полученный из растительного продуцента фито-ИФН-а-2Ь-6Н1Б.
Растительный продуцент обладает рядом преимуществ. В отличие от бактериальной системы экспрессии, в клетках высших растений осуществляются пострансляционные модификации, сходные с таковыми в клетках млекопитающих: гликозили-рование, фосфорилирование, метилирование и др., а также обеспечивается правильная укладка (фол-динг) рекомбинантного продукта, обеспечивающая сохранение белка растворимым [3; 19]. При использовании растений мы получаем белок, глико-зилированный по типу близкому к млекопитающим [13]. Мы предполагаем, что такой подход увеличит стабильность белка и снизит гуморальный ответ иммунной системы человека на введение высоких доз рекомбинантного ИФН-препарата.
1114 1
1 2 3 + S
Рис. 2. Регуляция ИФН-а-2 экспрессии генов БСЬ-2 и 1Ь17 в клетках ФЛЭЧ (А) и НСТ-116 (Б). По оси ординат - относительные уровни экспрессии генов.
По оси абсцисс - указаны типы клеток и исследуемые гены.
1 - Контроль (равен 1);
2 - Реаферон ИФН-а-2Ь;
3 - Растительный фитоИФН-а-2Ь-6Ш8;
4 - Бактериальный ИФН-а-2Ь-6Ш8;
5 - Бактериальный ИФН- а-2а
В фибробластах лёгкого эмбриона человека (линия ФЛЭЧ-977) препараты ИФН-а-2 не влияли на гены своего семейства, но индуцировали транскрипцию генов других видов ИФН (ИФН-0-1 и ИФН-у). Подобной активации не происходило в опухолевых клетках. Сильный стимулирующий эффект на ген ИФН-у оказывал ИФН-а-2а. В фиб-робластах человека и опухолевых клетках эффект препаратов ИФН на протоонкоген Бс1-2 и ген ИЛ17 был противоположным. В нормальных фибробла-стах интерфероны индуцировали их экспрессию, а в опухолевых клетках наоборот - подавляли (рис. 2, А, Б).
Ранее полуколичественным методом ОТ-ПЦР была получена характеристика клеток карциномы простаты БШ45 в отношении экспрессии генов системы интерферона и апоптоза [8]. Показано положительное действие отечественных реком-бинантных препаратов ИФН-а-2 (Альфарона) и ИФН-у (Ингарон), а также двуспиральной (дс)РНК
44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ИНТЕРФЕРОНА...
(Ридостин) и синтетического комплекса поли(И)- В них снижены уровни активности генов се-поли(Ц) на уровни транскрипции генов клеточной мейства ИФН-а, но проявляется высокая конститу-защиты и продукцию некоторых интерлейкинов. тивная активность протоонкогена Bcl-2 и повыше-Результаты анализа в ИФН-обработанных ны уровни экспрессии генов ИФН-Х-1 и ИФН-клетках карциномы простаты DU145 во многом зависимых ферментов (ОАС1, дсПК и РНКазы), ИЛ совпадают с полученными на клетках аденокарци- 4 и ИЛ 17. Новые образцы человеческих рекомби-номы толстого кишечника НСТ-116. Наблюдалась нантных ИФН-а-2, полученные в ФГБУ «РОНЦ им. стимуляция синтеза мРНК ИФН-а, дсРНК- Н.Н. Блохина» РАМН, бактериального и расти-протеинкиназы, ОАС1 и РНК-азы L и подавление тельного происхождения обладают высокой проти-мРНК протоонкогена Bcl-2. Полученные на двух вовирусной активностью в клетках ФЛЭЧ-977 и типах опухолевых клеток (DU145 и НСТ-116) дан- нейтрализуются специфическими моноклональны-ные указывают на необходимость продолжения ми антителами. исследований с отечественными препаратами ре- Позитивным свойством исследованных пре-комбинантных ИФН и дсРНК. паратов ИФН-а-2 является подавление экспрессии протоонкогена Bcl-2 и активация экспрессии генов Заключение ИФН-а, ИФН-Х-1 и ИФН-зависимых ферментов в опухолевых клетках НСТ-116. Клетки аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 характеризуются отсутствием экспрессии Выражаем благодарность Колодяжной Л.В. ряда генов системы ИФН (ИФН-Р-1, ИФН-у, ИСГ- за техническую помощь в проведении опытов на 15) и сигнальных регуляторов апоптоза (Fas- клеточных культурах и в определении противови-рецептора и ИЛ6). русной активности ИФН. Литература 1. Ершов Ф.И., Киселёв О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств) - М.: Гэотар Медицина, 2005. - 368 с. 2. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник (2-е изд.) - М.: Геотар Медицина, 2006. - 312 с. 3. Зверева А.С., Петровская Л.Е., Родина А.В. и др. Экспрессия миелоцитокинов человека в растении // Биохимия. - 2009. - 74, вып. 11. - С. 1459-68. 4. Кособокова Е.И., КосоруковВ.С. Интерфероны в онкологии // Врач. - 2010. - №11. - С. 18-21. 5. Кособокова Е.Н., Косоруков В.С. Исследование влияния поли-His доменов на уровень экспрессии и эффективность очистки Интерферона-а-2Ь человека // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 4. - С. 107-12. 6. Соколова Т.М., Урываев Л.В. Способ определения цитокинового статуса на генетическом уровне. Патент на изобретение №2181773, 27 апреля 2002 г. 7. Соколова Т.М., Бибикова О.В., Быстров Н.С., Урываев Л.В. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека // Вопросы вирусологии. - 2005. - №1. - С. 19-21. 8. Соколова Т.М., Соколова З.А., Рубцова М.А., Барышников А.Ю. Экспрессия интерферонзависимых и апоптозных генов в клетках карциномы простаты DU145: влияние препаратов интерферонов и их индукторов - двуспиральных РНК // Российский биотерапевтический журнал - 2010. - Т 9, №1. -С. 53-6. 9. Bennett R.L., Carruthers A.L., Hui T. et al. Increased expression of the dsRNA-activated protein kinase PKR in breast cancer promotes sensitivity to doxorubicin // Plos one. - 2012. - 7(9). - e46040. 10. Chen J., BaingE, Fish E.N. Liversity and relatedness among the type I interferons // J. Interferon a. Cytokine Res. - 2004. -24. - P. 687-98. 11. Christian S.L., Dong Zu, Licursi M. et al. Suppression of iFN-induced transcription underlies IFN-defects generated by activated Ras/MEK in human cancer cells // Plos one. - 2012. - 7(9) - t44267. 12. Crichley-Torne R.J., Simons D.L., Yan N. et al. Impaired interferon signaling is a common immune defect in human cancer // Proc. Nat. Acad. Sci. - 2009. - 106(22). - P. 9010-5. 13. De Leede L.G., Humphries J.E, Bechet A.C. et al. Novel controlled-release Lemna-derived IFN-alpha2b (Locteron): pharmacokinetics, pharmacodynamics, and tolerability in a phase I clinical trial // J. Interferon a.Cytokine Res. - 2008. - 28(2). - P. 113-22. 14. De Veer M. J., Holko M., Frevel M. et al. functional classification of interferon-stimulated genes identified using microaarays // J. Leukoc.Biol. - 2001. - 69. - P. 912-20. 15. George P.M., Badiger R., Alazawi W. et al. Pharmacology and therapeutic potential of interferons // Pharmacology a. Theura-peutics. - 2012. - 135. - P. 44-53. 16. Hamzaoul A., Brahim M.B. Inflamatory response in induced sputum mononuclear cells from patiants with acute exacerbation asthma // Mediators of Inflamation. - 2000. - 9(3-4). - P.147-55. 17. Hilkens C.M., Sohlaak J.F., Kerr I.M. Differential responses to IFN-alpha subtypes in human T cells and dendritic cells // J. Immunol. - 2003. - 171. - P. 5255-363. 18. Ignatenko N.A., Yerushalmi H.F., Pandey R. et al. Gene expression analysis of HCT-116 colon tumor-drived cells with poly-amine analog PG-11047 // Cancer genomics a. Proteomics. - 2009. - 6. - P. 161-76. 19. Komarova T.V., Baschieri S., Donini M. et al. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals // Expert Rev Vaccines. - 2010. - 9(8). - P. 859-76. 20. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDeltaC(T) // Methods - 2001. - 25. - P. 402-8. 21. Pitha I.F., Pitha P.M. Viral defense carcinogenesis and ISG15: Novel roles for old ISG // Cytokine Growth Factor Rev. - 2007. - 18(5-6). - P. 409-17. 22. PlataniasL.C. Mechanisms of type 1- and type-II- interferon-mediated signaling // Nat. Rev. immunol. - 2005. - 5. - P. 375-86. 23. Rho H.W., Lee B.C., Choi E.S. Identification of valid reference genes for gene expression studies of human stomach cancer by reverse transcription-qPCR // BMC Cancer. - 2010. - 10. - P. 240-53. 24. SandlerA.J., Williams B.R.G. Interferon inducible antiviral effectors // Nat. Rev. immunol. - 2008. - 8(7). - P. 559-68. 25. Wainwringht D.A., Sengupta S., Han Y. et al. The presence of IL-17A and T helper 17 cells in experimental mouse brain tumors and human glioma // Plos one. - 2010. - 5(10). - P. 1-7. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОРКРАЩЕНИЙ ИФН - интерферонов ИСГ - ИФН-стимулированного гена ЦПД - цитопатогенного действия ЭМК - энцефаломиокардит мышей
№ 3/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
