CC BY
66
© Резуненко Ю.К., Прокопов В.О.
УДК: 614.777:543.39:547.42
АКТИВНІСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ЗА УМОВ ТРИВАЛОГО ВПЛИВУ ПОЛІОЛІВ НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛУ, ЕТИЛЕН- І ПРОПІЛЕНГЛІКОЛЮ
Резуненко Ю.К., Прокопов В.О.
Харківський національний медичний університет, м. Харків
Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва НАМН України, м. Київ
В работе исследована активность антиоксидантной системы крови крыс в условиях длительного воздействия промышленных химических загрязнителей окружающей среды - полиолов в дозах 1/10 и 1/100 ЬБ50, что является необходимым для раскрытия механизмов их биологического действия. Спектрофотометрическими и колориметрическими методами определена активность ферментативного звена антиоксидантной системы крови и содержание восстановленного глутатиона. Полиолы на основе глицерола (П-1103К, П-3003), этилен- и пропиленгликоля (П-1601Б, 3502) в дозе 1/10 ЬБ50 на 30-е сутки влияния снижают активность супероксиддис-мутазы и глутатионпероксидазы эритроцитов, каталазы крови, содержание восстановленного глутатиона на фоне повышения активности церулоплазмина сыворотки крови. Доза 1/100 ЬБ50 вызывает снижение активности каталазы и супероксиддисмутазы на фоне повышения активности глутатионпероксидазы и церулоплазмина, концентрации восстановленного глутатиона. Повышение показателей антиоксидантной системы свидетельствует об активации адаптивных реакций организма крыс в ответ на неблагоприятное воздействие веществ, а снижение - об усилении окислительного метаболизма, повышении продукции активных форм кислорода, активации процессов перекисного окисления липидов и белков, способных преодолеть барьер антиок-сидантной защиты. Полученные результаты необходимы для гигиенического нормирования полиолов и составления прогноза их неблагоприятного влияния на здоровье населения.
Ключевые слова: полиолы, глутатион.
крысы, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, церулоплазмин,
Вступ
Наслідки активації вільнорадикальних процесів залежать від ефективності роботи системи антиради-кального та антиперекисного захисту, діяльність якої направлена на утилізацію токсичних продуктів. Ця система включає ряд ферментів, низькомолекулярних сполук, фізіологічно активних речовин білкової та ліпідної природи, ефект захисту яких може бути реалізованим через інгібування радикалів перекисного типу та виділення їх з ланцюга окислення (принцип дії токоферолів), дезактивацію перекисних радикалів (принцип дії глутатіону, цистеїну), взаємодію з активними формами кисню, включаючи ферменти (суперо-ксиддисмутазу, каталазу, глутатіонпероксидазу та інші) та через ряд інших процесів [1, 2]. Дослідження закономірності змін антиоксидантного статусу організму за умов дії хімічних факторів служить моделлю для характеристики його резистентності. Поліоли на основі гліцеролу (П-1103К, П-3003), етилен- і пропіле-нгліколю (П-1601Б, П-3502) належать до поширених промислових хімічних забруднювачів водоймищ, у тому числі, джерел водопостачання населення, що пов'язано з їх широким використанням у промисловості та побуті як миючих засобів, емульгаторів, антикорозійних і бактерицидних препаратів тощо [5]. Доведена можливість надходження речовин даного класу до організму людини із питною водою. Регламентація вмісту поліолів в об'єктах навколишнього середовища здійснюється на базі використання тимчасових розрахункових нормативів. Проте, механізми біологічної дії цих сполук вивчені недостатньо, а саме їхнє ураху-
вання є підставою для адекватної регламентації та обґрунтування медико-біологічних і профілактичних заходів щодо захисту здоров'я населення та довкілля.
Робота виконана у рамках науково-дослідної роботи Харківського національного медичного університету «Вивчення механізмів біологічної дії простих поліефірів у зв'язку з проблемою охорони навколишнього середовища» (номер держреєстрації
011011001812).
Метою дослідження була оцінка тривалого впливу поліолів на основі гліцеролу (П-1103К, П-3003), етилен- і пропіленгліколю (П-1601Б, П-3502) у дозах 1/10, 1/100 Ю50 на стан показників активності системи ан-тирадикального та антиперекисного захисту в крові щурів.
Матеріали і методи дослідження
У роботі використано зразки речовин з регламентованими фізико-хімічними характеристиками: бути-лаліловий ефір поліоксипропіленоксиетиленгліколя -П-1601Б, поліоксипропілентриол - П-1103К, поліокси-етиленоксипропілентриол - П-3003, поліоксиетилен-оксипропіленгліколь - П-3502. Експерименти проведено на статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар масою (180-220) г. Тварини утримувалися у стаціонарних умовах віварію за постійної температури та природного освітлення у пластикових клітках на збалансованому харчовому раціоні [6, 9]. Проведення процедур з експериментальними тваринами здійснено згідно з вимогами Державного комітету з етики. Щурів піддавали пероральній затравці, за допомогою зонда, водними розчинами речовин, щоденно одноразово
протягом 30 діб у дозах 1/10 і 1/100 Ш50. Це відповідно складало для П-1601Б - 0,385 і 0,0385 г/кг; П-1103К - 0,12 і 0,012 г/кг; П-3003 - 0,32 і 0,032 г/кг; П-3502 - 0,39 і 0,039 г/кг маси тварин. Тваринам контрольної групи вводили відповідні об'єми води. Дослідження біохімічних параметрів крові здійснювали на 30-ту добу після початку експерименту. Забій тварин проводили шляхом декапітації, попередньо анестезуючи тіопенталом натрію.
Активність супероксиддисмутази (СОД) (КФ
1.15.1.1) еритроцитів визначали спектрофотометричним методом при довжині хвилі 540 нм за ступенем інгібування відновлення нітросинього тетразолію [3]. Активність каталази (КТ) (КФ 1.11.1.6) визначали у ге-молізаті крові спектрофотометричним методом [4], що базується на кольоровій реакції з молібдатом амонію, в результаті якої перекис водню утворює стійкий комплекс з солями молібдену. Активність церулоплазмі-ну (ЦП) (КФ 1.16.3.1) визначали в сироватці крові за методом [11], що базується на реакції ферментативного окислення парафенілендіаміну, розчин якого готували безпосередньо перед використанням. Проби інкубували протягом однієї години у сухоповітряному термостаті при 37°С та колориметрували при 530 нм. Активність глутатіонпероксидази (ГПО) (КФ 1.11.1.9) еритроцитів визначали за методом [10]. Мірою активності ГПО була швидкість окислення відновленого
глутатіону (ВГ) в присутності гідроперекису третинного бутилу. Вміст ВГ визначали у гемолізаті крові спектрофотометричним методом за допомогою реактиву Елмана [7]. Для перевірки гіпотез щодо рівності генеральних середніх двох незалежних, незв'язаних вибірок використовували ^критерій Стьюдента з попередньою перевіркою нормальності розподілу варіант [8].
Результати та їх обговорення
Першу лінію антирадикального та антиперекисно-го захисту складають ферменти - СОД і КТ. Досліджувані поліоли виявили суттєвий вплив на їх активність (табл. 1). Дія 1/10 Ю50 призвела до достовірного зниження активності СОД еритроцитів в середньому на 52% порівняно з контролем, при цьому найбільш виразний вплив виявив поліол 1103К (на 55%). Доза 1/100 Ш50 чинила таку ж спрямованість зміни активності СОД, але менш виразно - в середньому на 44%. При цьому найбільш сильна дія спостерігалася для поліолу 1103К (на 49%), а найменш - для 3502 (на 38%). На 30-ту добу за дії поліолів у дозах 1/10 і 1/100 Ш50 визначалося також й достовірне зниження в середньому на 52% і 23% активності КТ крові, порівняно з контролем. Для поліолу 1601Б це відповідно складало 51% і 22%, 1103К - 58% і 30%, 3003 - 58% і 23%, 3502 - 41% і 17%.
Таблиця 1
Вплив поліолів на активність супероксиддисмутази еритроцитів, каталази крові та вміст церулоплазміну сироватки щурів
(30-а доба, М±т, п=10)
Поліол Доза, Ю50 Супероксид- дисмутаза, ммоль/хв-г гемоглобіну Каталаза, мкмоль/хвг гемоглобіну Церулоплазмін, мкмоль/л
1601Б 1/10 8,7±0,79* 224,8±12,6* 0,87±0,057*
1/100 9,3±0,95* 354,9±30,8* 0,65±0,053*
1103К 1/10 7,5±0,71* 190,2±15,3* 0,93±0,082*
1/100 8,6±0,83* 318,6±29,2* 0,74±0,072*
3003-2-60 1/10 1/100 7,9±0,82* 9,2±0,86* 188,7±12,1* 347,5±30,7* 0,79±0,068* 0,68±0,056*
3502-2 Б-40 1/10 1/100 8,4±0,85* 10,4±0,92* 238,9±32,0* 377,5±33,1* 0,91±0,083* 0,74±0,057*
Контроль 16,8±1,62 454,2±32,3 0,46±0,042
Примітка: * - р<0,05 відносно контролю
Достовірне зниження активності СОД та КТ за умов тривалого впливу досліджуваних речовин є однією з причин розвитку оксидативного стресу, так як дані ферменти несуть відповідальність за видалення первинних активних форм кисню - супероксидних ані-он-радикалів і перекису водню.
ЦП - головний антиоксидантний білок плазми крові, якому притаманна СОД-подібна дія. Спостерігали достовірне, порівняно з контролем, підвищення його вмісту за умов впливу як 1/10 Ю50, так й 1/100 Ю50, яке складало відповідно 90% і 53%. Такі зміни можна розглядати як адаптивну реакцію організму щурів на несприятливий вплив поліолів.
У процесах інактивації гідроксипероксидів ліпідів значну роль відіграє ГПО. На 30-ту добу впливу по-
ліолів відмічалася різна динаміка змін активності ферменту, яка залежала від уведеної дози. Так, дія 1/10 Ю50 супроводжувалася суттєвим зниженням активності ГПО - на 57%, 68%, 61% і 50% відповідно для 1601 Б, 1103К, 3003 і 3502, порівняно з контролем. Вплив 1/100 Ю5о, навпаки, призводив до достовірного підвищення активності ГПО в середньому на 42%, при цьому найбільш виразну дію чинив поліол 1103К (табл. 2). Зниження активності ГПО можливо пов'язане з виснаженням компенсаторних реакцій, направлених на нормалізацію процесів перекисного окислення ліпідів за умов тривалого впливу речовин, а збільшення активності - може бути наслідком посилення адаптаційних реакцій в організмі експериментальних тварин.
Таблиця 2
Вплив поліолів на активність глутатіонпероксидази еритроцитів і вміст відновленого глутатіону крові щурів (30-а доба,
М±т, п=10)
Поліол Доза, LD50 Глутатіонпероксидаза, ммоль/хв-г гемолобіну Відновлений глутатіон, ммоль/л
1601 Б 1/10 1/100 0,12±0,009* 0,38±0,026* 0,28±0,024* 0,77±0,081*
1103К 1/10 1/100 0,09±0,008* 0,42±0,035* 0,19±0,020* 0,84±0,077*
3003-2-60 1/10 1/100 0,11±0,009* 0,39±0,040* 0,31±0,026* 0,92±0,085*
3502-2 Б-40 1/10 1/100 0,14±0,012* 0,40±0,032* 0,28±0,019* 0,83±0,079*
Контроль 0,28±0,025 0,52± 0,045
Примітка: * - р<0,05 відносно контролю
Відомо, що всі тіолові сполуки мають антирадика-льну й антиперекисну активність. У силу своєї гідрофільності вони функціонують як водорозчинні антиоксиданти, які захищають нуклеїнові кислоти, білки та інші компоненти клітин від оксидативного стресу. Наявність у молекулах тіолів гідрофобних груп робить можливим їх взаємодію з ліпідними структурами клітин. Співвідношення оксидантної та антиоксидантної систем підтримується на певному рівні співвідношенням сульфгідрильних і дисульфідних груп [12].
Тривалий вплив поліолів у дозі 1/10 ЇО50 призводив до зниження вмісту ВГ у цільній крові щурів в середньому на 45% порівняно з контролем. Найбільш сильну зміну цього показника викликав поліол 1103К, а саме на 63%, найменш виразну - поліол 3003 на 40%. Доза 1/100 Ш50, як й у випадку активності ГПО, збільшувала вміст ВГ на 48%, 62%, 77% і 31% відповідно для 1601Б, 1103К, 3003 і 35020 (табл. 2). Рівень ВГ залежить від швидкості синтезу, катаболізму, а також стану ферментативних систем, які регулюють співвідношення його окислених і відновлених форм. Зниження вмісту ВГ під впливом 1/10 Ю50, ймовірно, пов'язано як з порушенням синтезу у зв'язку з гепато-токсичною дією цієї дози поліолів, так й з посиленим використанням відновленої форми для знешкодження продуктів вільнорадикального окислення. Підвищення вмісту ВГ за дії 1/100 Ю50 скоріше пов'язане з активацією адаптаційних механізмів у відповідь на тривалий вплив речовин.
Узагальнюючи отримані результати, можна зробити наступні висновки:
1. Тривала дія поліолів на основі гліцеролу (П-1103К, П-3003), етилен- і пропіленгліколю (П-1601, П-3502) призводить до напруження системи антиради-кального та антиперекисного захисту в організмі щурів з поступовим виснаженням за дії 1/10 І050, що підтверджується зниженням активності супероксиддис-мутази та глутатіонпероксидази еритроцитів, каталази крові, вмісту відновленого глутатіону .
2. На 30-ту добу досліджувані поліоли у дозах 1/10 і 1/100 1650 підвищують в сироватці крові вміст
церулоплазміну, що можна розглядати як адаптивну реакцію організму щурів на їх несприятливий вплив.
3. Зниження активності антиоксидантної системи щурів за умов тривалого впливу поліолів може бути викликаним посиленням окислювального метаболізму, збільшенням продукції активних форм кисню, активацією процесів перекисного окислення ліпідів і ві-льнорадикальної модифікації білків, здатних перебороти бар'єр антиоксидантного захисту.
Література
1. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-
антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии. - К. : Наукова думка, 1997.- 420 с.
2. Бєленічев І.Ф., Губський Ю.І., Левицький Е.Л., Коваленко
С.І., Марченко О.М. Антиоксидантна система захисту організму // Соврем. проблемы токсикологии. - 2003. - № 2. - С. 32-38.
3. Гуревич В.С., Конторидинова К.Н. Сравнительный анализ
двух методов определения активности супероксиддис-мутазы // Лаб. дело. - 1990. - № 4. - С. 44-47.
4. Дубинина Е.Е., Ефимова Л.Ф., Софронова Л.Н. Методы
определения активности каталазы // Лаб. дело.- 1988. -№ 8. - С. 16-19.
5. Жуков В.І., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.І. Прос-
тые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов. - Х.: Торнадо, 2000. - 438 с.
6. Кожем’якін Ю.М., Хромов О.С., Філоненко М.А., Сайфетді-
нова Г.А. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними.- К.: Авіценна, 2002. - 156 с.
7. Кочетов Т.А. Практическое руководство по энзимологии.-
М., 1980. - С. 217.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 154 с.
9. Ланг С.М., Уилсон Д. Лабораторная крыса // Лаборатор-
ные животные. - 1993. - Т. 3, № 2. - С. 100-110.
10. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глютатионпероксидазы в эритроцитах // Лаб. дело. - 1986. - № 2. - С. 724-727.
11. Мошков К.А., Бурмистров С.О., Усатенко М.С., Гриненко А.Я., Петров В.П., Маслов В.Г., Бородкин Ю.С. Активность и содержание церулоплазмина в крови людей при острой и хронической алкогольной интоксикации // Фармакология и токсикология. - 1986. - № 1. - С. 92-96.
12. Yang M. Effect of suifhydryi reagents on spectrum states in the erythrocyte membrane // Biochem. Biophys. Res. Com-mun. - 1993. - Voi. 192, № 2. - P.918-925.
Summary
ACTIVITY OF ANTIOXIDANT SYSTEM IN RAT ORGANISM AT CONDITIONS OF PROLONGED INFLUENCE OF POLYOLS STRUCTURALLY BASED ON GLYCEROL, ETHYLEN- AND PROPYLENGLYCOLS Resunenko Y.K., Prokopov V.A.
Key words: polyols, rats, superoxidedismutase, catalase, glytationeperoxidase, cerulloplasmin, glutathione.
The present study reports the results of investigation of rat's blood antioxidant system activity at conditions of prolonged influence of environmental chemical polluters e.g. polyols in 1/10 and 1/100 LD50. The work results make an important contribution in establishment of the substances biological action mechanism. The activity of blood antioxidant system en-
zymic link and reduced glutathione contents were investigated by spectrofluorometric and colorymetric methods. Polyols which are structurally based on glycerol (P-1103K; P-3003), ethylene- and propylenglyceols (P-1601B; 3502) in 1/10 LD50 decrease the activity of erythrocytes superoxidedismutase and glutathione peroxydase, blood catalase, glutathione contents on the background of increase in blood serum cerulloplasmin activity. The substance 1/100LD50 results in decrease of catalase and superoxide dismutase activity on the background of the increase in glutathione peroxidase and cerulloplamin activities and in reduced glutathione contents. The induction of antioxidant system indices signifies the activation of rat organism's adaptive reactions as a response to the substances negative influence. On the contrary, the reduction of antioxidant system indices may testify of increase in oxidative metabolism, the increase in oxygen active forms production, lipids and proteins peroxidations e.g. the negative processes which are capable of overcoming antioxidant protection limits. The obtained results may be very useful in hygienic norming the polyols environmental limits threshold concentrations and elaboration of prognosis of the substances negative action on the population health.
Матеріал надійшов до редакції 23.11.2011
