CC BY
73 . 2022 Shmakova A . A ., Klimovich P S ., Rysenkova K . D . et al . Urokinase Receptor uPAR Downregulation in Neuroblastoma Leads to Dormancy, Chemoresistance and Metastasis // Cancers . 2022 . V. 16 . N 4 . P. 994. DOI: 10 . 3390/cancers14040994.
Активация аутофагической гибели клеток рака молочной железы при использовании ингибиторов PI3K/Akt/mTOR
Авторы
Григорьева Диана Дмитриевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Жидкова Екатерина Михайловна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Жукова Ольга Игоревна, [email protected], ФГБОУ ВО «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва
Лылова Евгения Сергеевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Якубовская Марианна Геннадиевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Лесовая Екатерина Андреевна, [email protected], ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Ключевые слова:
рак молочной железы, аутофагия, глюкокортикоиды, рапамицин, вортманнин
Актуальность
Рак молочной железы (РМЖ) — гетерогенная группа заболеваний, различающихся гистогенезом, генетическими нарушениями, клиническим течением и прогнозом. Химиотерапия РМЖ имеет широкий спектр недостатков (развитие инфекционных осложнений, гормональные нарушения и др.). Комбинация с синтетическими глюкокортикоидами (ГК) позволяет расширить терапевтический интервал и снизить общую токсичность основных терапевтических агентов. Однако один из побочных эффектов ГК — способность инициировать аутофагию, ведущую к выживанию трансформированных клеток [1].
Уровень аутофагии в клетке может быть подавлен при активации пролиферативного комплекса mTORC1, в связи с чем актуальной является оценка возможности введения в качестве адъювантов в терапию опухолей ингибиторов сигнального пути PI3K/Akt/mTOR для усиления аутофагии в клетках опухоли, вплоть до формирования аутолизосомы и гибели клеток.
Цель
Настоящая работа посвящена анализу действия ингибиторов PI3K/Akt/mTOR рапамицина и вортман-нина на ГК-индуцируемую аутофагию в клеточных линиях РМЖ.
Материалы и методы
Клеточные линии РМЖ культивировали в среде DMEM (для MCF-7) или КРМЫ640 (для НСС-1954), содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят, L-глютамин (2мМ), пенициллин и стрептомицин (по 50 ед/мл) (всё — «ПанЭко», Россия) при 37 °С в ат-
мосфере 5% СО2. Клетки рассаживали по 1 млн кл/ мл, после прикрепления вносили 10 нМ рапамицина, вортманнина (LC Labs, США) или 100 нМ декса-метазона (KRKA, Чехия) и инкубировали 24 ч. Для исследования совместного действия препаратов и ГК обработку дексаметазоном проводили по прошествии 4 часов инкубации с ингибиторами. Оптимальная схема обработки клеток была подобрана ранее [2]. При помощи Вестерн-блоттинга была оценена экспрессия ключевых мишеней белкового комплекса mTOR (p-4E-BP1 и pS6K), а также экспрессия белков Beclin-1 и Phospho-Beclin-1 (Ser93), которые являются основными маркерами, связанными с аутофагией в клетках злокачественных новообразований.
Результаты
Показано, что дексаметазон снижает эффективность вортманнина и рапамицина в отношении ин-гибирования mTOR в клетках РМЖ. В то же время дексаметазон способствует накоплению белка Phospho-Beclin-1 (Ser93) в клетках линии MCF-7, а инкубация обеих линий с комбинацией ГК и ингибиторов mTOR приводит к усилению экспрессии маркеров аутофагии в 2-3 раза.
Выводы
Поскольку длительный прием ГК приводит к слабой активации аутофагии, способствуя выживанию и формированию резистентности опухоли, представляется перспективным исследование эффектов ингибиторов PI3K/Akt/mTOR на гиперактивацию аутофагии для индукции клеточной гибели.
Финансирование: грант РНФ 17-75-20124.
Список литературы
1. Laane E . et al . Cell death induced by dexamethasone in lymphoid leukemia is mediated through initiation of autophagy //
Cell Death & Differentiation . 2009 . V. 16 . № 7 . P 1018-1029 . 2 . Григорьева Д . Д . и др . Ингибирование глюкокортикоид-индуцированной экспрессии REDD1 рапамицином в клетках рака молочной железы // Успехи молекулярной онкологии . 2022 . Т 9 . № 1. С . 42-46 .
Исследование нативной автофлуоресценции иммунных клеток дренирующих лимфоузлов на модели мышиной меланомы B16F0 методом флуоресцентной микроскопии с временным
разрешением
Авторы
Изосимова Анна Вячеславовна, [email protected], ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород
Можеров Артем Михайлович, [email protected], ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород
Загайнова Елена Вадимовна, [email protected], ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород
Южакова Диана Владимировна, [email protected], ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород
Ключевые слова:
метаболизм, флуоресцентная время-разрешенная микроскопия, иммунотерапия, лимфоциты
Актуальность
Одной из основных проблем иммунотерапии опухолей является отсутствие возможности предсказания эффективности лечения на ранних этапах. Реактивность лимфоцитов против опухоли отражается в метаболических перестройках, и они могут служить потенциальным индикатором раннего ответа на лечение [1]. Перспективным методом оценки энергетического метаболизма является визуализация автофлуоресцирующих коферментов методом флуоресцентной время-разрешенной микроскопии FLIM [2], однако работы по FLIM-визуализации нативной автофлуоресценции свежеизвлеченных иммунных клеток пока отсутствуют.
Цель
Исследование нативной автофлуоресценции иммунных клеток дренирующих лимфоузлов на модели мышиной меланомы B16F0 методом FLIM.
Материалы и методы
Исследования проводили на мышах линии C57B1/6 FoxP3-EGFP с подкожно привитой мелано-мой B16F0 вблизи пахового лимфоузла. Визуализацию свежих срезов дренирующих лимфоузлов проводили на конфокальном микроскопе LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM приставкой TCSPC (Becker & Hickl, Германия) в канале кофермента никотина-мидадениндинуклеотид (фосфата) НАД(Ф)Н (ex. 375 нм, em. 435-485 нм).
Результаты
Разработан оригинальный способ визуализации нативной автофлуоресценции иммунных клеток, включающий забор лимфоузлов под сте-реомикроскопом Leica M60, приготовление свежих срезов толщиной около 1 мм, помещение на чашку FluoroDish (WPI) со стеклянным дном и фиксация салфеткой, смоченной физиологическим раствором.
Методом FLIM в канале НАД(Ф)Н продемонстрировано, что у здоровых мышей наблюдается наименьшее значение отношения свободной компоненты НАД(Ф)Н к связанной с ферментами а1/ а2 (2,36±0,08). У мышей с опухолью наблюдается увеличение отношения а1/а2 с ростом опухоли: от 2,6±0,1 для мышей с объемом опухоли до 200 мм3 до 3,4±0,2 для мышей с объемом опухоли 250-400 мм3 (p = 0,0003 против здоровых мышей). Данный эффект может быть связан со сдвигом в сторону гли-колитического метаболизма, что может быть ассоциировано с активацией и пролиферацией лимфоцитов в ответ на опухоль. Увеличение размеров лимфоузлов подтверждает данную гипотезу.
Предварительные результаты по анти-СТЬА-4 терапии (анти-СТЪА-4 антитела (Bio X Cell, США), 250 мкг на мышь на 7, 8, 11 и 12-й дни роста опухоли) показали, что у части мышей, ответивших на терапию (с торможением роста опухоли) а1/а2 выше, чем у нелеченых мышей с аналогичным объемом опухоли (3,1±0,17 против 2,7±0,03).
