CC BY
61
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3
Е.В.КЛЫШКО, А.П.ИЛЬИНА, Г.Н.ЛИХАЦКАЯ, М.П.ИСАЕВА, К.В.ГУЗЕВ, М.М.МОНАСТЫРНАЯ, Э.П.КОЗЛОВСКАЯ, А.В.ЛИПКИН, Е.И.БАРСОВА, И.Б.КРЫЖКО,
Е.В.ТРИФОНОВ, Е.А.НУРМИНСКИЙ
Актинопорины: структура и функция
Методами структурной белковой химии и генетической инженерии установлены аминокислотные последовательности фрагментов двух цитолизинов тропической актинии Radianthus macrodactylus RTX—A и RTX—SII (138 и 141 аминокислотных остатков соответственно). Оба цитолизина отнесены согласно их физико-химическим и биологическим свойствам к группе актинопоринов. Изучено действие RTX—S II на ионную проницаемость бислойных липидных мембран, показано, что он является сфин-гомиелинзависимым каналообразующим цитолизином, формирующим в мембранах олигомерные ион-проводящие комплексы. Установлено ингибирующее действие RTX—S II на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа, что может свидетельствовать о взаимодействии актинопоринов с белковыми компонентами цитоскелета клеточной мембраны. Методом сравнительного моделирования получены пространственные модели фрагментов RTX—A и RTX—S II и выявлены их различия в функционально важных участках. Теоретически предсказано образование комплекса актинопорина со структурным белком мембраны, G—актином. В результате образования комплекса возможны нарушение полимеризации актина и ингибирование пролиферации клетки.
Actinoporins: The structure and action. E.V.KLYSHKO, A.P.IL’INA, G.N.LIKHATSKAYA, M.P.ISAEVA, K.V.GUZEV, M.M.MONASTYRNAYA, E.P.KOZLOVSKAYA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), A.V.LIPKIN, E.I.BARSOVA (M.M.Shemyakin—Yu.A.Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS, Moscow), I.B.KRYZHKO, E.VTRIFONOV, E.A.NURMINSKY (Institute of Automation and Control Processes, FEB RAS, Vladivostok).
The amino acid sequences of two fragments of cytolysins RTX—A and RTX—S II (138 and 141 amino acids, respectively) from the sea anemone Radianthus macrodactylus have been determined by methods of the structural protein chemistry and genetic engineering. According to their molecular weight, physical—chemical and biological properties, both cytolysins RTX—A and RTX—S II have been referred to the actinoporin group. The RTX—S II action on the ion permeability of the bilayer lipid membranes has been studied. It has been shown that mechanism of the cytolysin action consists in formation of the sphingomyelin—dependent oligomer ion channels in membranes. The actinoporin inhibitory action on the sea urchin eggs has been ascertained that
КЛЫШКО Елена Владимировна, ИЛЬИНА Анна Павловна, ЛИХАЦКАЯ Галина Николаевна, ИСАЕВА Марина Петровна — кандидат медицинских наук, ГУЗЕВ Константин Викторович, МОНАСТЫР-НАЯ Маргарита Михайловна — кандидат химических наук, КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна — доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток), ЛИП-КИН Алексей Валерьевич — кандидат химических наук, БАРСОВА Екатерина Ивановна — кандидат химических наук (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва), КРЫЖКО Игорь Борисович — кандидат физико-математических наук, ТРИФОНОВ Евгений Викторович — кандидат физико-математических наук, НУРМИНСКИЙ Евгений Алексеевич — доктор физико-математических наук (Институт автоматики и процессов управления ДВО РАН, Владивосток).
Работа частично поддержана грантом РФФИ № 02-04^9486, программой ФХБ РАН и грантами ДВО РАН по поддержке фундаментальных исследований и исследований молодых ученых.
allows assuming the interaction of actinoporins with proteins of a cell membrane. The 3D—structures of fragments of cytolysins RTX—A and RTX—S II have been obtained by comparative modeling methods and their distinctions in functionally important sites have been revealed. The actinoporin—G—actin complex formation has been theoretically predicted. This formation can result in changes of the actin polymerization and inhibition of the cell proliferation.
Известно, что актинии, относящиеся к типу Coelenterata, являются богатейшим источником биологически активных соединений полипептидной природы, таких как нейро- и цитотоксины, протеолитические ферменты, ингибиторы проте-иназ [5, 25, 28]. Нейротоксины являются модуляторами и блокаторами Na+ и К+ каналов и используются в качестве инструментов в нейрофизиологических и фармакологических исследованиях. В настоящее время возрос интерес к веществам, обладающим мембранотропным и цитостатическим действием, лежащим в основе противоопухолевого, кардиостимулирующего, дерматонекротического, антимикробного, антипаразитарного и других фармакологических свойств этих соединений, и в последнее десятилетие в изучении цитолизинов актиний наблюдается значительный прогресс [8].
Более чем из 30 видов актиний выделены и охарактеризованы цитолитические токсины, которые на основании их первичной структуры и физико-химических свойств были разделены на 4 группы [8]. К I группе относятся цитолизины с молекулярной массой (м. м.) 5—8 кДа, выделенные из Radianthus macrodactylus [2] и Tealia felina [15]. II группу цитолизинов составляют высокоосновные полипептиды (р1 9 и выше) с м. м. 20 кДа, так называемые актинопорины, выделенные из различных видов семейств Actiniidae и Stichodactylidae [23]. B III группу входят летальные цитолитические фосфолипазы А2 (30—40 кДа) из Aiptasia pallida [18] и подобные им по физико-химическим свойствам цитолизины без ферментативной активности из Urticina piscivora [13]. Единственным представителем IV группы хо-лестеринингибируемых цитолизинов является метридиолизин, выделенный из актинии Metridium senile [4, 11], c м. м. 80 кДа.
Наиболее изучены цитолизины II группы: эквинатоксины, стихолизины и магни-фикализины, выделенные из Actinia equina [16], Stichodactyla helianthus [14] и Heteractis magnifica [21] соответственно. К настоящему времени установлены аминокислотные последовательности восьми зрелых актинопоринов [8]. Для эквинаток-сина II установлена кристаллическая структура [10]. Показано, что актинопорины оказывают мембранотропное действие на сфингомиелинсодержащие мембраны эукариот, формируя в них катионселективные ионные каналы (поры), состоящие из 3—4 молекул [3, 14]. В основном работы по изучению механизма действия актино-поринов направлены на исследование их взаимодействия с липидами, входящими в мембрану [3, 12, 17, 22]. К настоящему времени механизм этого процесса до конца не выяснен, но авторами [3, 8, 10, 14, 17, 22, 23, 28] была предложена модель для описания процесса порообразования, согласно которой цитолизин взаимодействует своим богатым триптофанами участком с липидным бислоем, причем это взаимодействие обратимо и не приводит к лизису клетки. Затем N-концевой фрагмент молекулы цитолизина проникает в липидный бислой, конформация молекулы изменяется, образуется достаточно прочный комплекс цитолизина с липидным матриксом, в котором формируются поры, приводящие к нарушению проницаемости мембраны.
Установление структур новых актинопоринов продолжает оставаться актуальным в свете существующей гипотезы Нортона [27] об их роли видовых хемотаксо-номических маркеров; кроме этого остается невыясненным механизм взаимодействий актинопоринов с мембранными белками клеток, которые, несомненно, вносят свой вклад в процессы трансмембранного транспорта ионов и метаболитов.
В настоящее время уровень функциональных исследований зависит от знаний первичной, вторичной, третичной структур биологически активных полипептидов, позволяющих использовать современные методы молекулярного моделирования.
Целью настоящей работы является выделение и установление аминокислотной последовательности актинопоринов из Radianthus macrodactylus методами структурной белковой химии и генетической инженерии, построение пространственной модели актинопоринов и их комплексов со структурным белком клеточной мембраны G-актином методами компьютерного моделирования.
Выделение, физико-химические и биологические свойства актинопорина RTX-S II
Ранее мы выделили и охарактеризовали три высокомолекулярных (20 кДд) цитолизина RTX-A (Ala), RTX-S (Ser) и RTX-G (Gly) из актинии Radianthus macrodactylus, которые показали высокую гемолитическую, токсическую и цитотоксичес-кую активности. Для актинопорина RTX-A (Ala) была установлена аминокислотная последовательность N-концевого фрагмента, состоящего из 31 аминокислотного остатка [26]. Был исследован механизм действия RTX-A на биологических (эритроциты человека, кролика, собаки) [1, 31] и модельных (БЛМ, липосомы различного липидного состава) мембранах [3, 6] и показано, что актинопорин формирует как в тех, так и в других катионселективные ионные каналы. Установлено, что мембранотропное действие полипептида ингибируется экзогенным сфингомиелином.
В данном исследовании мы выделили из R. macrodactylus новый полипептид, обладающий гемолитической активностью и не проявляющий фосфолипазную активность. Схема выделения включала гельпроникающую и ионообменную хроматографии в режиме нормального давления, а также ионообменную и обращенно-фазовую
2,5
1,5 '
- 1
0,5
А Б
■100 RTX-S II ,.
RTX-S и :
А | %в
5 *
1 і і 5 / \
f 1 ' і >
II' ■50 2 / І * ■
1 І : fN /
J 1 ; LL¡ ' /
1; Ó / і і
A J V 1
І- 0 0 1
50
100 Время, мин
150
200
10 15
Время, мин
100
%В
20
Рис. 1. Хроматография гемолитически активных фракций из Ка&апШш шасі^асіуїш. А: ионообменная ВЭЖХ на колонке икгорас Т8К CM-3SW, уравновешенной 0,1 М аммонийно-ацетатным буфером, рН 6,0. Элюция проводилась в градиенте концентрации (пунктирная линия) от 0 до 100 % раствора В (1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0) в растворе А (0,1 М аммонийно-ацетатный буфер, рН 6,0), скорость элюции 1 мл/мин. Б: обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке 242 КисІеоБІї С18 (2,0x75 мм); элюция в ступенчатом градиенте концентрации (пунктирная линия) от 0 до 65 % растворителя В (ацетонитрил) в растворе А (0,1 %-ная трифторуксусная кислота в воде); скорость элюции 200 мкл/мин
ВЭЖХ (рис. 1). В результате был получен гомогенный по данным капиллярного электрофореза полипептид, молекулярная масса которого составляла согласно данным SDS-электрофореза в градиенте плотности ПААГ 20 кДа, изоэлектрическая точка — около 10. Согласно N-концевому анализу он был назван RTX-S II, так как отличался от выделенного нами ранее акти-нопорина RTX-S временем удерживания при ВЭЖХ на колонке Ultropac TSK CM-3SW и имел некоторые различия в аминокислотном составе.
Гемолитическая актив-
ность RTX-S II составила 3,6-104 ГЕ/мг белка. Наиболее близки по гемолитической активности актинопорины сти-холизин II из S. helianthus (3,14-104 ГЕ/мг) и магнифика-лизины I и II из H. magnifica (3,6104 и 3,3104 ГЕ/м соответственно) [14, 21]. Наличие еще одного представителя ак-тинопоринов не вызывает удивления, так как известно, что эти полипептиды существуют в виде изоформ с очень близкими физико-химическими характеристиками и принадлежат к мультигенно-му семейству [7].
Действие цитолизина RTX-S II на ионную проницаемость мембран изучено с помощью техники бислойных липидных мембран (БЛМ). Обнаружено, что RTX-S II вызывает дискретные изменения проводимости мембран, содержащих сфингомиелин, при добавлении в водную фазу с одной стороны мембраны (рис. 2). Действие цитолизина на ионную проницаемость мембран зависит от их липидного состава и рН среды. Активность цитолизина увеличивается при действии на мембраны, содержащие сфингомиелин, и наибольшая она в слабощелочной среде; проявляется при концентрациях 2—100 нг/мл, сопоставимых с действующими концентрациями актинопоринов из других тропических видов актиний. Анализ величины флуктуаций проводимости, индуцированной RTX-S II в моноолеиновых БЛМ, содержащих 10 % сфинго-миелина, показал, что наиболее вероятная проводимость каналов составляет 72 ± 8 пСм в 0,1 М NaCl при рН 7,2. Зависимость интегральной проводимости мембран от концентрации цитолизина (рис. 3) показала, что при изменении концентрации RTX-S II в 10 раз проводимость мембраны увеличивается
на 4 порядка. Это указывает на участие 4 молекул полипептида в образовании олигомерного ион-проводящего комплекса в мембране. Таким образом, механизм действия RTX-S II на мембраны состоит в сфингомиелинзависимом формировании в липидном бислое олигомерных ион-проводящих структур, детальное строение которых предполагается изучить в дальнейшем. Цитолизин RTX-S II по своим физико-химическим свойствам и механизму действия на проницаемость мембран можно отнести к группе актинопоринов.
Установление аминокислотной последовательности актинопоринов RTX-S II и RTX-A
Установлена аминокислотная последовательность N-концевого фрагмента RTX-S II: SAALAGTITLGASLG-. При сравнении этого фрагмента с аналогичными аминокислотными последовательностями других актинопоринов, а также с последовательностью RTX-A была обнаружена высокая степень их гомологии. Однако некоторые различия в первичной структуре позволили нам синтезировать прямые специфичные праймеры к N-концевым участкам последовательностей RTX-A (А: 5 ’-GCTATTATT/C/AGCNGGNGC-3 ’) и RTX-S II (S: 5-ACAAT-TAT/CTCTCGGGGCAAGTCTAGG-3’). Обратный праймер (R: 5’-ATG CCA TCC A/GTT A/GTC NCC-3’) был синтезирован к высокогомологичному С-концевому участку последовательностей актинопоринов (рис. 4).
При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами А и R в качестве матрицы была использована полноразмерная кДНК-библиотека R. macrodactylus. ПЦР-фрагмент, содержащий около 420 пар оснований (п. о.), был клонирован в pTZ19R (Fermentas) и секвенирован. На основании полученной нуклеотидной последовательности была выведена частичная аминокислотная последовательность RTX-A (138 АК). При установлении аминокислотной последовательности RTX-S II ПЦР проводилась с праймерами S и R и геномной ДНК, выделенной из щупалец актинии. Нуклеотидная последовательность, состоящая из 423 п. о. и кодирующая 141 аминокислоту, была получена при прямом секвениро-вании ПЦР-фрагмента. Ранее было показано, что гены, кодирующие актинопори-ны, не содержат интронов [9]. Мы также не обнаружили интронных нуклеотидных последовательностей, по крайней мере на этом участке кодирующего региона. Идентичность полученных последовательностей RTX-A (138 АК) и RTX-S II (141 АК) составляет 89 %, а с учетом консервативных замен — 95 % (рис. 4).
При множественном выравнивании аминокислотных последовательностей методом CLUSTLW была обнаружена высокая степень гомологии RTX-A и RTX-S II c HET3, магнификализином из H. magnifica (87 % и 96 % соответственно) и с CYT1, CYT2, стихолизинами из S. helianthus (84—86 % и 87—91 % соответственно). Такая высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей RTX-A и RTX-S II с магнификализином и стихолизинами может быть
Рис. 3. Зависимость интегральной проводимости мембран из 1 %-ного моноолеина в н-гептане, содержащих 10 % сфингомиелина, от концентрации токсина ЯТХ-8 II в водной фазе (0,1 М №01, 5 тМ Тпв-Н01, pH 7,2) с одной стороны мембраны. Данные приведены в двойном логарифмическом масштабе. Наклон кривой п=4,1
RTX-SII -------TITL GASLGFQILD KVLGELGKVS RKIAVGVDNE SGGSWTALNA YFRSGTTDVÍ 54
RTX-A .....PlSLT4QlB SlABIjGQVS RKIAIGTDNE SGGSWTAMNA YFRSGTTDvl 50
HET3 SAALAGTIIE GASLGFQILD ftiGBLGKVS RKIAVGVDNE SGGSWTALNA YFRSGTTDVI 60
CYT2 --ALAQTIIA GASLTFQVLD KVLEELGKVS RKIAVGIDNE SGGTWTALNA YFRSGTTDVI 58
CYT1 -SELAGTIID GASLTFEVLD KVLGELGKVS RKIAVGIDNE SGGTWTALNA YFRSGTTDVÍ 59
EQT5 SVAVAGAVIE GATLTFNVLQ TVLKALQDIS RKIAVGIDNE SGMTWTAMNT YFRSGTSDV] 60
EQT4 SVAVAGAIIK GAALTFNVLQ TVLKALQDIS RKIAVGVDNE SGKTWTALNT YFRSGTSDIV 60
SrcI -KISGGTVIA AGRLTLDLLK TLLGTLGSIS RKIAIGVDNE TGGLITGNNV YFRSGTSDD| 59
EQT2 SADVAGA VID GASLSFDILK TVLEALQNVK RKIAVGVDNE SGKTWTALNT YFRSGTSDIV 60
RTX-SII LPEFVPNQKA LLYSGRKDTG PVATGAVAAF AYYMSNGHTL GVMFSVPFDY NLYSNWWDVK 114
RTX-A LPEFVPNQKA LLYSGRKN'RG PDITGAVGAL AYYMSNGNTL GVMFSVPFDY NLYSNMNDVK 110
HET3 LPEFVPNQKA LLYSGRK3TG PVATGAVAAF AYYMSNGHTL GVMFSVPFDY NFYSMMDVK 120
CYT2 LPEFVPNTKA LLYSGRKIDTG PVATGAVAAF AYYMSSGNTL GVMFSVPFW NWYSOTfMDVX 118
CYT1 LPEWPNTKA LLYSGRKSSG PVATGAVAAF AYYMSNGNTL GVMFSVFV3 NWYSNNNDVJ 119
EQT5 LPHTVPHGKA LLYNGQKDRG PVATGVVGVL AYAMSDGNTL AVLFSIPFDY NLYSHWWNVK 120
EQT¿ LPHKVPHGKA LLYNGQKDRG PVATGAVGVL AYAMSDGNTL АЯрвЫКВ NWyBCTOfNVR 120
SrcI LPHRVETGEA LLYTARKTKG PVATGAVGVF TYYLSDGNTL AVLFSVPFDY NFYSMNIfNVX 119
EQT2 LPHKVPHGKA LLYNGQKDRG PVATGAVGVL AYLMSDGNTL AVLFSVPYDY NWYSNWWNVR 120
RTX-SII IYSGKRRADQ AMYEDMYYG- NPYRGDNG------------------------ - 141
RTX-A aHHlBs- - ---138
HET3 VYSGKRRADQ ОШмШ- KPYRGDNGWH QKNLGYGLRM KGIMTSAGEA ILQIRISR - 177
CYT2 IYSGKRRADQ GMYBDLYYG- NPYRGDNGWH EKNLGYGLRM KGIMTSAGEA KMBKiH- - 175
CYT1 lYPGKRRjSp HHmH|- BRC3DNGWY QKNLGYGLRM KGIMTSAGEA Km9ki|-- 176
EQT5 VYKGHRRADQ RMYEELYYNL SPFRGDNGWH NRDLGYGLKG RGFMNSSGQS HeIhJTKA- 179
EQT4 IFKGRRRADQ RMYEQLYYYL SPF¿3Ewap ERhHHkS r1f(n|gIq1 НеШЛТКА- 179
SrcI. IYSGKRNADY DMYHELYYDA NPFEGDDTWE YRYLGYGMRM EGYMNSPGEA ILKITVMPD- 178
EQT2 IYKGKRRADQ RMYEELYYNL SPFRGDNGWH TRNLGY-GLK SRGFMNSSGH AILEIHVSKA-179
Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей зрелых цитолизинов актиний. RTX-S II, RTX-A — актинопорины R. macrodactylus; HET3 - магнификализин H. magnifica (Swiss-prot, Q9U6X1); CYT1, CYT2 — актинопорины S. helianthus (Swiss-prot, P81662, P07845); EQT2, EQT4, EQT5 — эквинатоксины A. equina (Swiss-prot, P17723, Q9Y1U9, Q93109); SrcI — цитолизин
Sagartia rosea (TrEMBL, AAP04347). Жирным шрифтом показан участок, богатый остатками ароматических аминокислот
объяснена принадлежностью этих видов актиний, R. macrodactylus, H. magnifica и S. helianthus, к одному семейству Stichodactylidae.
Сравнение последовательностей актинопоринов показало высокую консервативность фрагмента FDYNLYSNWWDVKIY, содержащего большое количество ароматических аминокислотных остатков (выделены). Установлено, что именно этот фрагмент молекулы участвует в связывании с поверхностью мембраны [8]. Кроме того, не изменяются число и положение остатков пролина (Р-изгибы). Основные различия в аминокислотных последовательностях актинопоринов находятся на N- и С-концевых участках молекулы, тогда как средний участок последовательности этих полипептидов очень консервативен. Показано, что именно N-концевой, вариабельный а-спиральный, участок полипептидной цепи участвует в формировании поры в цитоплазматической мембране и отвечает, таким образом, за мембранолитическую активность актинопоринов [8].
Пространственная структура фрагментов актинопоринов RTX-A и RTX-S II
Эквинатоксин II, выделенный из актинии A. equina, стал первым акти-нопорином, кристаллическая структура которого определена в 2001 г. с разрешением 1,9 Á [10]. Недавно установлена кристаллическая структура еще одного ак-тинопорина — стихолизина II из актинии Stoichactis helianthus c разрешением 1,7 Á [24]. Показано, что молекула актинопорина — это однодоменный белок, со-
Идентичность (%) аминокислотных последовательностей фрагментов RTX—A и RTX—S I и актинопоринов в базе данных PDB, определенная с помощью SWISS-MODEL сервера
Актинопорины R. macrodactylus 1iaz 1kd6 1gwy
RTX-A 73,1 73,1 86,6
RTX-S II 71,7 71,7 90,8
Таблица 2
Величина параметра RSMD, рассчитанная с помощью программы SPDBV, для Са атомов RTX—A, RTX—S II, эквинатоксина II (1iaz) и стихолизина II (1gwy)
1iaz 1gwy RTX-A RTX-S II
RTX-A RTX-S II 0,39 0,36 - 0,05 0,40 0,35 0,05 -
стоящий из 12 p-цепей, образующих гидрофобный кор, и двух а-спиралей, ассоциированных симметрично с двух сторон кора. Пространственные структуры эквинатоксина II и стихолизина II с элементами вторичной структуры, полученные с помощью программы Molmol, показаны на 3-й сторонке обложки, рис. 3. Молекула актинопорина, как показано методом ЯМР, имеет жесткое строение в водном растворе за исключением конформации подвижного N-конца [20].
Изучена конформация актинопорина в воде при температуре 300 К методом молекулярно-динамической симуляции и минимизации энергии с помощью пакета GROMACS (http://www.gromacs.org), установленного в межведомственном супер-компьютерном центре ДВО РАН. На 2-й сторонке обложки показан результат симуляции эквинатоксина в воде в течение 100 ps с шагом 0,002 ps. Обнаружено, что изменение конформации происходит в области подвижного N-концевого фрагмента молекулы.
Аминокислотные последовательности фрагментов актинопоринов RTX-A и RTX-S II имеют высокую степень идентичности с актинопоринами, пространственная структура которых установлена экспериментально (табл. 1).
Высокая степень идентичности аминокислотных последовательностей RTX-A и RTX-S II позволила нам получить пространственные структуры этих фрагментов с помощью автоматического сервера SWISS-MODEL [19, 29, 30].
После оптимизации петель и минимизации энергии сервером энергия молекул RTX-A и RTX-S II составляла -3945,506 кДж/моль и -4174,660 кДж/моль соответственно. Величины параметра RSMD, рассчитанные с помощью программы SPDBV, для Са атомов RTX-A, RTX-S II, эквинатоксина II и стихолизина II приведены в табл. 2. Как видно из табл. 2, точность полученных теоретических моделей высока (rsmd<0,5) и практически соответствует точности экспериментальных моделей, используемых в качестве прототипов. Различие между полученными моделями менее 0,05.
Сравнение пространственных структур фрагментов RTX-A и RTX-S II со структурой эквинатоксина II и стихолизина II позволило выяснить, где располагаются консервативные и вариабельные участки молекул. Наиболее консервативным участком является гидрофобный кор молекул, а вариабельные участки расположены в области больших и малых петель и двух а-спиралей, ассоциированных симметрично с двух сторон кора. В системе водородных связей фрагментов RTX-A и RTX-S II имеются различия: количество водородных связей больше в молекуле
RTX-S II, различия наблюдаются для остатков Asn33, Asp72, Asn92, Tyr116 и Asp129. Количество ионных связей во фрагментах молекул также различно. В молекуле RTX-A на одну ионную связь больше. Локализация ионных связей в структуре фрагментов RTX-A и RTX-S II показана на 3-й сторонке обложки, рис. 4.
Таким образом, впервые получены пространственные структуры для двух ак-тинопоринов, выделенных из тропической актинии R. macrodactylus, обнаружены различия в их функционально важных участках, которые могут лежать в основе различий физико-химических свойств и биологической активности.
Изучение взаимодействия актинопорина RTX-S II с актином
Ранее при изучении взаимодействия RTX-A с тенями эритроцитов человека и собаки помимо специфического липид-белкового связывания со сфингомие-лином было обнаружено взаимодействие актинопорина с интегральным мембранным белком G-актином. Факт взаимодействия был установлен по исчезновению на электрофоретических денситограммах теней эритроцитарных мембран, модифицированных актинопорином, полосы, соответствующей актину (43 кДа), и образованию новой, соответствующей белок-белковому комплексу актин-цитолизин [З1].
Нами исследовано цитолитическое действие RTX-S II на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа Strongylocentrotus intermedius, в мембранах которого сфингоми-елин отсутствует. Показано, что актинопорин в концентрации 10 мкг/мл (2S0 ГЕ) вызывает торможение дробления яйцеклеток, но не лизис клеток. Через 1,5 ч от начала оплодотворения обработанные цитолизином ооциты не отличались от контрольных, а через 20 ч находились на 13-й стадии ранней гаструлы, в то время как контрольные — на 15-й стадии средней гаструлы. Отсутствие сфингомиелина (специфического мембранного акцептора II группы цитолизинов актиний) в мембранах оплодотворенных ооцитов позволяет высказать предположение о связывании RTX-S II с мембранными белками и о влиянии на процессы пролиферации клеток.
С помощью программы GRAMM для предсказания белок-белкового взаимодействия по атомной структуре молекул мы показали возможность взаимодействия ак-тинопорина с актином в сравнении с комплексом актина и пептидного регулятора его полимеризации — профилина (см. 3-ю сторонку обложки, рис. 5). Механизм ингибирующего действия актинопоринов на пролиферацию клеток может быть связан как с нарушением проницаемости клеточных мембран, так и с образованием комплексов актинопоринов с актином, ингибирующих полимеризацию актина.
Таким образом, проведенное исследование показывает взаимосвязь между структурой и функцией актинопоринов — важных инструментов исследования молекулярной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брежестовский П.Д., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Действие гемолизина из морской анемоны Radianthus macrodactylus на эритроцитарную мембрану // ДАН СССР. 19SS. Т. 299. С. 74S—750.
2. Зыкова ТА., Монастырная М.М., Апаликова О.В., Швец ТВ., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из морской актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорган. химия. 1997. Т. 24. С. 509—516.
3. Иванов А.С., Мольнар А.А., Козловская Э.П., Mонаcтырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проводимость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 19S7. Т. 4. С. 243—24S.
4. Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Халилов Э.М., Еляков ГБ. Действие метридиолизина из морской анемоны Metridium senile на биологические и модельные мембраны // Биол. мембраны. 1988. Т. 5. С. 830—835.
5. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды. М.: Высш. шк., 1985. 280 с.
6. Руднев И.С., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Еляков ГБ. Действие гемолизина из морской анемоны Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1. С. 1019—1024.
7. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj B., Gubensek F., Maсek P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family // Toxicon. 1999. Vol. 37. P. 1391—1401.
8. Anderluh G., Maсek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 111—124.
9. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj B., Maсek P., Gubensek F. The coding region of the equinatoxin II gene lacks introns // Croat. Chem. Acta. 1995. Vol. 68. P. 533—542.
10. Athanasiadis A., Anderluh G., Maсek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina // Structure. 2001. Vol. 9. P. 341—346.
11. Bernheimer A.W., Avigad L.S. A cholesterol inhibitable cytolytic protein from the sea anemone Metridium senile // Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 541. P. 96—106.
12. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P 467—471.
13. Cline E.I., Wiebe L.I., Young J.D., Samuel D. Toxic effects of the novel protein UpI from the sea anemone Urticina piscivora // Pharm. Res. 1995. Vol. 32. P. 309—314.
14. de los Rios V, Mancheno J.M., del Pozo A.M., Alfonso C., Rivas G., Onaderra M., Gavilanes J.G. Sticholisin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus, is a monomer-tetramer associating protein // FEBS Letters. 1999. Vol. 455. P. 27—30.
15. Elliott R.C., Konya R.S., Vickneshwara K. The isolation of a toxin from the Dahlia sea anemone, Tealia felina L. // Toxicon. 1986. Vol. 24. P. 117—122.
16. Ferlan I., Jackson K.W. Partial amino acid sequence of equinatoxin // Toxicon. 1983. Vol. 21 (Suppl. 3). P. 141—144.
17. Galettis P., Norton R.S. Biochemical and pharmacological studies of the mechanism of action of tene-brosin C, a cardiac stimulatory and hemolytic protein from the sea anemone, Actinia tenebrosa // Toxicon. 1990. Vol. 28. P. 695—706.
18. Grotendorsta G.R., Hessinger D.A. Purification and partial characterization of the phospholipase A2 and co-lytic factor from sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom // Toxicon. 1999. Vol. 37. P. 1779—1796.
19. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. Vol. 18. P. 2714—2723.
20. Hinds M.G., Zhang W., Anderluh G., Hansen PE., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II. Implications for pore formation // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 315. P. 1219.
21. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo H.E., Gopalakrishnakone P, Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica // Toxicon. 1993. Vol. 31. P. 1567—1579.
22. Macek P., Belmonte G., Pederzolli C., Menestrina G. Mechanism of action of equinatoxin II, a cytolysin from the sea anemone Actinia equina L. belonging to the family of actinoporins // Toxicology. 1994. Vol. 87. P. 205—227.
23. Maсek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea-anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 105. P. 121—130.
24. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez-Ripol M., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1—20.
25. Mebs D., Gebauer E. Isolation of proteinase inhibitory, toxic and hemolytic polypeptides from a sea anemone, Stoichactis sp. // Toxicon. 1980. Vol. 18. P. 97—106.
26. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.W., Shwets T.W., Kozlovskaya E.P Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1197—1217.
27. Norton R.S., Maсek P., Reid G.E., Simpson R.J. Relationship between the cytolysins tenebrosin-C from Actinia tenebrosa and equinatoxin II from Actinia equina // Toxicon. 1992. Vol. 30. P 13—23.
28. Norton R.S. Structure and function of peptide and protein toxins from marine organisms // J. Toxicol. — Toxin Rev. 1998. Vol. 17. P. 99—130.
29. Peitsch M.C. Protein modeling by E-mail // Bio/Technology. 1995. Vol. 13. P. 658—660.
30. Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 3381—3385.
31. Shnirov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Int. 1992. Vol. 26. P. 219—229.
