CC BY
137
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 1
Почвенная микробиология
УДК 579.64+631.572:633.1
АЭРОБНОЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКОЕ СООБЩЕСТВО АССОЦИАНТОВ СФАГНОВОГО МХА Sphagnum fallax КАК ОСНОВА В ПРОЦЕССАХ ДЕСТРУКЦИИ ПОЖНИВНЫХ ОСТАТКОВ*
А.В. ЩЕРБАКОВ1, И.В. РУСАКОВА2, О.В. ОРЛОВА1, Н.И. ВОРОБЬЕВ1,
О.В. СВИРИДОВА1, Е.Н. ЩЕРБАКОВА3, В.К. ЧЕБОТАРЬ1
В настоящее время в сельскохозяйственной практике остро стоит проблема утилизации отходов производства, в частности наиболее актуальным остается вопрос о переработке стерни и соломы зерновых культур. Методом накопительных культур из тканей сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. нами выделена аэробная целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА), стабильная при периодическом культивировании в жидкой минеральной среде с добавлением целлюлозы. Установлено таксономическое положение пяти доминантных компонентов сообщества и изучены их физиолого-биохимические свойства. В микрополевом опыте проведено сравнение эффективности утилизации растительных остатков зерновых культур изучаемого ЦМА, а также культуры Bacillus subtilis Ч-13 и микробного препарата баркон. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о влиянии культур микроорганизмов на процессы гумификации и минерализации соломы в почве, что позволяет дать обоснованную агроэкологическую оценку эффективности использования соломы зерновых культур совместно с биопрепаратами в специализированном зерновом севообороте. Эффективность изучаемого ЦМА в отношении ускорения минерализации и гумификации пожнивных остатков ячменя, внесенных в пахотный слой дерново-подзолистой почвы в качестве удобрения, доказана на основании изменения следующих показателей: повышения численности микроорганизмов — деструкторов свежего органического вещества, увеличения коэффициента минерализации и содержания микробной биомассы, усиления эмиссии СО2, роста актуальной целлюлозолитической активности и содержания легкоразлагаемого органического вещества. Активность ЦМА была максимальной в начальные сроки после инокуляции и заделки соломы в почву.
Ключевые слова: сфагновые мхи, целлюлозолитическая микробная ассоциация, утилизация стерни и соломы зерновых культур.
В настоящее время в сельскохозяйственной практике остро стоит проблема утилизации отходов сельскохозяйственного производства, в частности особенно актуальными остаются вопросы переработки стерни и соломы зерновых культур. Общая масса получаемой соломы злаковых в мире оценивается в 2900 млн т (1), причем большая ее часть сжигается, что значительно загрязняет окружающую среду и запрещено законом во многих странах, в том числе в России. Показано, что к наиболее эффективным и безопасным способам переработки стерни злаковых относится ее деструкция с использованием микробиологических препаратов (2-4).
Ранее нами отмечалось, что сфагновые мхи служат уникальными местообитаниями для микроорганизмов (5), которые могут быть перспективны для сельскохозяйственной биотехнологии (6, 7). Кроме того, имеются сведения о присутствии представителей Actinobacteria и Strepto-myces, которые активно осуществляют деструкцию природных полимеров, в том числе целлюлозы, в составе торфяных отложений сфагновых болот (8, 9).
Цель настоящей работы — выделение бактериальных ассоциантов сфагновых мхов, обладающих целлюлозолитической активностью, и изучение влияния этих микроорганизмов на процессы разложения растительных остатков и баланс гумуса в почве.
* Работа поддержана грантом РФФИ 09-04-91007-АНФ_а и выполнена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» отделения земледелия Российской академии сельскохозяйственных наук Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии в рамках госконтракта № 16.552.11.7085.
54
Методика. Ассоциацию целлюлозолитических бактерий выделяли из образцов сфагновых мхов Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr., ранее отобранных в районе оз. Волоярви (Ленинградская обл.) (7). Для изоляции бактерий использовали метод накопительных культур в жидкой среде Гетченсона (10) с pH 5,0. Для этого 3-5 растений мха, отмытых в стерильном физиологическом растворе, тщательно перетирали в асептических условиях с добавлением 10 мл физраствора до кашицеобразного состояния. Затем по 1 мл полученной растительной массы вносили в колбы с 50 мл среды Гетченсона и складчатым фильтром из фильтровальной бумаги. Посевы инкубировали стационарно 14 сут при температуре 20 °С, периодически встряхивая, и отмечали изменения в структуре складчатого фильтра. По результатам роста в накопительной культуре отобрали один образец, у которого наблюдалась максимальная степень разложения фильтровальной бумаги.
При определении стабильности целлюлозолитической ассоциации провели 10 последовательных пассажей культуры, для чего по 100 мкл первоначальной суспензии вносили в колбы с 200 мл среды Гетченсона с добавлением 5 г измельченной фильтровальной бумаги и инкубировали 7 сут при 20 °С с аэрацией (220 об/мин), отмечая изменения в цвете и консистенции фильтровальной бумаги.
Полученную культуру, представляющую собой смесь бактериальной массы и остатков полудеградированых волокон целлюлозы, исследовали под микроскопом («Ломо», Россия) в живых и окрашенных препаратах
(10) . Целлюлазную активность сообщества определяли по методике Кассана
(11) в сравнении с обладающей целлюлазной активностью жидкой культурой Bacillus subtilis 4-13 из коллекции лаборатории технологии микробных препаратов Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ). Для разделения ассоциации и выделения доминантных форм чистых культур суспензию методом последовательных серийных разведений высевали на поверхность агаризованой среды Гетченсона с 1 % микрокристаллической целлюлозы и инкубировали 7 сут при 20 °С. Колонии бактерий отсевали на свежие чашки Петри и в пробирки со скошенным агаром и описывали культурально-морфологические свойства полученных изолятов. Их физиолого-биохимические признаки исследовали методом мультисубстратного анализа с применением системы GEN III Microplate («BioLog», США).
Для молекулярно-генетической идентификации чистых культур доминантных изолятов бактериальную ДНК выделяли с помощью стандартного метода (лизис лизоцимом и SDS с последующей экстракцией с помощью фенола и хлороформа). Фрагмент гена ^S-рРНК амплифицирова-ли с использованием праймеров BD1/FD1 (12), ампликоны после очистки из геля секвенировали согласно протоколу фирмы «Beckman Coulter» (США) для 8-канального секвенатора SEQ8000 с коммерческим набором SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) with Quick Start Kit.
Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью программы BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
Влияние целлюлозолитической ассоциации на процессы разложения растительных остатков и баланс гумуса в почве исследовали в микрополевом опыте, заложенном осенью 2011 года после уборки ярового ячменя (сорт Зазерский 85) на опытном поле Всероссийского научно-исследовательского, конструкторского и проектно-технологического института органических удобрений и торфа (ВНИИОУ) согласно схеме: 1 — без удобрений (контроль); 2 — солома ячменя (5 т/га); 3 — солома ячменя
55
(5 т/га) + N50; 4 — солома ячменя (5 т/га) + N50 + препарат баркон (ВНИИСХМ) (13-15); 5 — солома ячменя (5 т/га) + N50 + культура B. sub-tilis 4-13; 6 — солома ячменя (5 т/га) + N50 + культура ЦМА. Опыт закладывали на двух полях, площадь опытной делянки 3,36 м2 (2,1*1,6 м), повторность опыта 4-кратная. Почва участка дерново-подзолистая супесчаная. В эксперименте использовали солому ячменя с опытного поля ВНИИОУ. Солому после уборки зерна измельчали (размер фрагментов
1-3 см) и равномерно распределяли по делянке вручную из расчета указанной выше дозы. После этого по поверхности соломы распределяли компенсирующую дозу азота (N50) в виде аммиачной селитры и изучаемые культуры микроорганизмов согласно схеме опыта. В тот же день (28 августа 2011 года) обработанную таким образом солому равномерно заделывали в почву на глубину 0-20 см (модель зяблевой вспашки).
Для оценки влияния применяемых культур микроорганизмов на скорость трансформации соломы и показатели плодородия дерново-подзолистой почвы изучали минерализационные потери (эмиссию CO2 из пахотного слоя почвы) — абсорбционным методом по И.Н. Шаркову каждые 7 сут (16); численность основных физиологических групп микроорганизмов (ФГМ) — посевом почвенной суспензии на агаризованные и жидкие питательные среды (10); содержание микробной биомассы (Смик) — методом регидратации-экстракции (17); динамику содержания азота — по ГОСТ (18); нитрифицирующую способность (НС) — по методу Крав-кова; актуальную (полевую) целлюлозолитическую активность — по доле (%) разложенной целлюлозы; содержание углерода, экстрагируемого горячей водой (Сэгв), — согласно описанию (17). Учет величины и структуры урожая у ярового сорта тритикале Амиго и статистическую обработку полученных данных выполняли по Б.А. Доспехову (19). Углерод микробной биомассы определяли в динамике после заделки соломы ячменя (с 6 сентября по 9 ноября 2011 года) и в течение вегетационного периода 2012 года (с 4 мая по 6 сентября).
Результаты. Методом накопительной культуры в жидкой минеральной среде с добавлением целлюлозы была выделена целлюлозолитическая микробная ассоциация, которая через 14 сут инкубации практически
А
Б
Рис. 1. Аэробная целлюлозолитическая ассоциация микроорганизмов, выделенная из тканей сфагнового мха Sfagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.: A — колонизация бактериями волокон целлюлозы, Б — жидкая культура целлюлозолитической микробной ассоциации на 14-е сут роста; 1 — активно развивающиеся целлюлозолитические микроорганизмы, 2 — остатки деградированного целлюлозного волокна. Неокрашенный препарат; световая микроскопия, увеличение Х1000.
полностью разрушала структуру субстрата и изменяла его физические свойства; в результате сама накопительная культура представляла собой смесь
56
культуральной жидкости желтого цвета и остатков целлюлозных волокон. Дальнейшее микроскопическое исследование накопительной культуры показало, что целлюлозные волокна активно колонизируются комплексом микроорганизмов, представленных разными морфологическими типами, основу которого составляют грамотрицательные неспорообразующие палочки различной морфологии (рис. 1).
В результате ряда последовательных пересевов с культивированием в аэробных условиях в жидкой среде с периодическим встряхиванием было установлено, что изучаемая культура стабильна и активно деградирует целлюлозные волокна, разрушая структуру целлюлозного фильтра и окрашивая культуральную жидкость в желтый цвет. Сравнительный тест на целлюлазную активность в агаризованной среде выявил, что диаметр зоны деградации целлюлозы в варианте с исследуемой ЦМА составляет 70 мм, в то время как для контрольной культуры B. subtilis 4-13 он не превышал 30 мм.
Методом последовательных серийных разведений с высевом на агаризованную среду Гетченсона с 1 % микрокристаллической целлюлозы ассоциацию разделили на пять доминантных бактериальных изолятов (каждый способен расти в чистой культуре), и их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства были охарактеризованы (табл. 1). По результатам молекулярно-генетической идентификации установлено, что в состав сообщества входят следующие микроорганизмы, различающиеся по таксономическому положению: B. cereus, Variovorax sp., Delftia sp., Flavobacterium sp., Rhodococcus erythropolis.
1. Физиолого-биохимические свойства доминантных компонентов изучаемой целлюлозолитической микробной ассоциации, выделенной из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.
Характеристика
Рост при pH 5,0 + + + + +
Рост при 1 % NaCl + + + + +
Оптимум t, °С 28 28 28 28 28
Разжижение желатина + - - + -
Усвоение углеводов и их производных:
целлюлоза - - - + +
декстрин + ± - + -
D-мальтоза + - - + -
D-трегалоза + - - - +
D-целлобиоза + - - + -
гентиобиоза + - + + -
сахароза + - - + +
D-тураноза + - - - ±
D-рафиноза - - - + -
D-лактоза - - - - -
D-мелибиоза ± - - + -
a-D-глюкоза + + - + -
D-манноза - + - + -
D-фруктоза + + + + +
D-галактоза - + + + -
D-фруктоза + + + - -
L-фруктоза + + + + -
L-рамноза + + - + -
инозин + + -
D-сорбитол - + + - +
D-маннитол - + - +
D-арабитол - + - - +
глицерол + + - - +
инозитол + - - +
пектин + - + +
«О ' J
У to
I 3
к
S 2 Рч СО <3 53 d <5 СО
Vario sp. CA2 Delfti CA3 о fS § <
о
&
S О
57
Продолжение таблицы 1
Усвоение аминокислот:
D-аспарагин - + + + +
D-серин + - - + -
L-аланин, L-аргинин + + + - +
L-аспарагин + - - + +
L-глутамин + + + + -
L-гистидин + + + + +
L-серин + + - - +
Усвоение органических кислот:
галактуроновая + - + + +
галактоновая - + - - -
глюконовая + + + - +
глюкуроновая + + + + -
глюкуронамид + + + - -
муциновая - - + - -
хинная + + + - +
молочная + + + + +
лимонная + + + + +
а-кетоглутаровая + + + - -
яблочная + + + - +
ацетоуксусная + + + - +
пропионовая + + + - +
уксусная + + + + +
муравьиная + + + - ±
Примечание. «+» — проявление признака, «-» — отсутствие проявления признака, «±» — частичное проявление признака.
Данные, полученные в микрополевом опыте с применением культуры изучаемого целлюлозолитического сообщества, а также B. subtilis 4-13 и микробного препарата баркон, свидетельствовали об их влиянии на процессы гумификации и минерализации соломы в почве, что позволяет дать обоснованную агроэкологическую оценку эффективности использования соломы зерновых совместно с микробными культурами в специализированном зерновом севообороте.
Микробная биомасса может служить важным показателем, характеризующим биологическое состояние пахотных почв и отражающим влияние агротехнических факторов. Согласно результатам анализа, динамика содержания микробной биомассы (Смик) в пахотном слое почвы на делянке име-
ности (рис. 2). Все ва-
„ , „ , „ , , рианты с применени-
Рис. 2. Динамика содержания микробной биомассы (Смик) в па- r г
хотном сёое дерново-подзоёистой супесчаной почвы в зависимости ем кулыур микроор-от варианта испоёьзования со.юмы ячменя (сорт Зазерский 85) в ганизмов на 10-е сут сочетании с иссёедуемыми микробными куёьтурами: 1 — без удоб- после заделки соло-рений, 2 — солома 5 т/га, 3 — солома 5 т/га + N50, 4 — солома 5 т/га + N50 + препарат баркон, 5 — солома 5 т/га + N50 + Bacillus subtilis 4-13, 6 — солома 5 т/га + N50 + целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА), выделенная из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. (микрополевой опыт,
Владимирская обл., 2011-2012 годы).
мы превосходили по величине Смик контроль на 15-30 %. В последующие два срока наблюдений (13 октября и 9 ноября) в этих вариантах поддерживались более высокие показатели с максимальными значениями в 5-м и 6-м вариантах (в среднем
58
529-541 мг/кг почвы, что на 10-13 % выше, чем в варианте, когда в почву вносили неинокулированую микробами солому). Осенью после уборки тритикале наибольшим содержанием углерода микробной биомассы Смик также характеризовались 5-й и 6-й варианты (соответственно с культурой B. sub-tilis 4-13 и ЦМА).
Рис. 3. Кумулятивные кривые эмиссии СО2 (С-СО2) в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазер-ский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами: 1 —
без удобрений, 2 — солома 5 т/га, 3 — солома 5 т/га + N50,
4 — солома 5 т/га + N50 + препарат баркон, 5 — солома
5 т/га + N50 + Bacillus subtilis 4-13, 6 — солома 5 т/га + N50 + целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА), выделенная из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr. (микрополевой опыт, Владимирская обл., 2011-2012 годы).
Наблюдения за размерами эмиссии СО2 из почвы в динамике, начиная с
1-х сут после заделки соломы с биологическими препаратами, и расчет кумулятивных кривых эмиссии двуокиси углерода по вариантам опыта (рис. 3) показали, что за период наблюдений (63 сут) минимальное количество СО2 выделилось из почвы в контроле (вариант без удобрений, 72,5 г/м2). При внесении соломы анализируемый показатель возрос в 1,5 раза (до 109,42 г/м2). Добавка компенсирую-
щей дозы минерального азота к соломе способствовала увеличению эмиссии углерода до 139,32 г/м2. Все использованные в опыте культуры микроорганизмов проявили высокую эффективность в отношении интенсификации разложения растительной биомассы соломы, что зафиксировано по увеличению объемов выделения СО2. За срок наблюдений в вариантах с внесением культур микроорганизмов объемы выделившегося CO2 были в сумме на 32-58 % выше, чем в случае, когда солому не инокулировали микроорганизмами и не добавляли компенсирующую дозу азота, и на 4-24 % выше по сравнению с вариантом, когда солому вносили совместно с N50. Согласно полученным данным, по интенсивности влияния на минерализационные потери СО2 в проведенном опыте культуры микроорганизмов можно расположить в последовательности: B. subtilis 4-13 > ЦМА > микробный препарат баркон.
Экспериментальные данные, полученные при исследовании динамики содержания минерального азота в пахотном слое, свидетельствовали, что при добавлении компенсирующей дозы азота этот показатель значительно превышал контроль во все сроки отбора проб. Следует отметить вариант с применением ЦМА, в котором анализируемый показатель во все сроки оставался наибольшим. В результате изучения динамики численности ФГМ, участвующих в круговороте углерода и азота, было установлено, что инокуляция культурами микроорганизмов и заделка соломы значительно увеличивают популяцию агрономически полезных групп микроорганизмов, особенно по данным на 9 ноября 2011 года. При использовании ЦМА наблюдался существенный рост численности аммонифицирую-
59
щих и амилолитических микроорганизмов, которая была максимальной в указанном варианте опыта (табл. 2).
2. Показатели биологического состояния дерново-подзолистой супесчаной почвы в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазер-ский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами (микрополевой опыт, Владимирская обл., 2011-2012 годы)
Численность микроорганизмов, тыс. КОЕ/г почвы
протеолитических (среда МПА) амилолитических (среда КАА) целлюлозолитических (среда Гетчинсона) микромицетов (среда Чапека) нитрифицирующих (водный агар) Clostridium pasterianum
Вариант
Км
Без удобрений 7934 17333 25,0 49,5 7,4 250 25 2,29
Солома 5 т/га 17834 24700 36,7 73,7 15,5 1500 150 1,43
Солома 5 т/га + N50 24767 40767 45,9 126,0 18,2 950 450 1,68
Солома 5 т/га + N50 + препарат баркон 18100 37167 37,7 92,2 31,3 45000 25 2,08
Солома 5 т/га + N50 + Bacillus subtilis Ч-13 15700 28534 30,9 109,5 24,2 4500 250 1,81
Солома 5 т/га + N50 + целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА) 47734 81000 38,2 100,2 24,6 250 95 1,73
Примечание. Км — коэффициент минерализации (над чертой — рез 1 год). ЦМА выделена из образцов сфагнового мха Sphagnum fallax (H.
через 3 Klinggr.
мес, под чертой — че-) H. Klinggr.
Проведенный микробиологический анализ показал, что, несмотря на общее снижение численности выявляемых ФГМ (по сравнению с осенними сроками определения), в вариантах с применением культур микроорганизмов суммарная биологическая активность была выше, чем при заделке неинокулированной соломы. При использовании ЦМА отмечались более высокие значение коэффициента минерализации Км. Через 1 год после внесения соломы и культур микроорганизмов (3 октября 2012 года) различия в интенсивности микробиологических процессов нивелировались по всем вариантам, но анализируемый показатель оставался на 2839 % выше, чем в варианте без удобрений.
При проведении анализов определение общей численности протеолитических почвенных микроорганизмов на МПА было дополнено учетом r-стратегов, быстро развивающихся за счет легкодоступных соединений. Их относительно высокая доля от общего числа выделяемых на МПА микроорганизмов, которую мы отмечали в вариантах с культурами B. sub-tilis Ч-13 (52 %) и ЦМА (46 %), может свидетельствовать о более активном освоении внесенного органического субстрата и энергично протекающих процессах минерализации.
Влияние обработки соломы культурой целлюлозолитической микробной ассоциации отразилось на содержании углерода, экстрагируемого горячей водой (Сэгв). Наблюдалась тенденция к увеличению этого показателя весной 2012 года (4 мая) в вариантах с внесением инокулированной соломы по сравнению с вариантами, где послеуборочные остатки не ино-кулировались микробными культурами. В почве, отобранной после уборки тритикале, различия по вариантам не зафиксировали. При учете урожайности ярового сорта тритикале не выявили достоверных различий по вариантам опыта. Можно отметить тенденции к снижению урожайности при заделке соломы без компенсирующей дозы азота и к увеличению урожайности при использовании ЦМА и B. subtilis Ч-13 и (табл. 3).
60
3. Урожайность тритикале (яровой сорт Амиго) в зависимости от варианта использования соломы ячменя (сорт Зазерский 85) в сочетании с исследуемыми микробными культурами (микрополевой опыт, почва дерново-подзолистая супесчаная, Владимирская обл., 2012 год)
Вариант Урожайность, Изменение урожайности
г/м2 г/м2 %
Без удобрений 150
Солома 5 т/га 143 -7 -5
Солома 5 т/га + N50 158 +8 +5
Солома 5 т/га + N50 + препарат баркон 158 +8 +5
Солома 5 т/га + N50 + Bacillus subtilis Ч-13 Солома 5 т/га + N50 + целлюлозолитическая 164 +14 +9
микробная ассоциация (ЦМА) НСР05 168 29,4 +18 + 12
Примечание. ЦМА выделена из образцов сфагнового мха Sphagnumfallax (H. Klinggr.) H. Klinggr.
Таким образом, в условиях микрополевого опыта (2011-2012 годы) выделенная нами целлюлозолитическая микробная ассоциация (ЦМА) показала эффективность в отношении ускорения минерализации и гумификации пожнивных остатков ячменя, внесенных в пахотный слой дерново-подзолистой супесчаной почвы в качестве удобрения, что было зарегистрировано по следующим изменениям показателей: по увеличению численности микроорганизмов — деструкторов свежего органического вещества; по увеличению коэффициента минерализации; по росту содержания микробной биомассы, увеличению эмиссии СО2, повышению актуальной целлюлозолитической активности; по увеличению содержания легкоразлагаемого органического вещества. Активность ЦМА была максимальной в начальные сроки после инокуляции и заделки соломы в почву.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sun X.F., Sun R.C., Tomkinson J., Baird M.S. Degradation of wheat straw lignin and hemicellulosic polymers by a totally chlorine-free method. Polymer Degradation and Stability, 2004, 83: 47-57.
2. Винаров А.Ю., Робышева З.Н., Сидоренко Т.В., Самойлова М.Б., Ипатова Т.Н. Способ микробиологической обработки целлюлозосодержащих материалов. А.с. 2169760 (РФ) МПК7 C 12 N 1/14. Винаров А.Ю. (РФ). № 99125130/13. Заявл. 29.11.99. Опубл. 27.06.01.
3. Воробьев Н.И., Свиридова О.В., Попов А.А., Русакова И.В., Петров В.Б. Граф-анализ генно-метаболических сетей почвенных микроорганизмов, трансформирующих растительные остатки в гумусовые вещества. Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 88-93.
4. Петров В.Б., Чеботарь В.К. Управление деструкцией и гумификацией пожнивных остатков зерновых культур с использованием микробиологического препарата экстрасол. Сельскохозяйственная биология, 2012, 3: 103-108.
5. Bragina A., Berg C., Cardinale M., Shcherbakov A., Chebotar V., Berg G. Sphagnum mosses harbor highly specific bacterial diversity during their whole lifecycle. The ISME Journal, 2012, 6(4): 802-813.
6. Shcherbakov A.V., Krikovtseva A.V., Kuzmina E.Yu., Berg C., Mal-fanova N.V., Cardinale M., Berg G., Chebotar V.K., Tikhonovich I.A. Endophytic and epiphytic bacteria associated with Sphagnum mosses as perspective objects for agricultural biotechnology. IOBC/WPRS Bulletin, 2012, 78: 165-171.
7. Щербаков А.В., Брагина А.В., Кузьмина Е.Ю., Берг К., Мунтян А.Н., Макарова Н.М., Мальфанова Н.В., Кардинале М., Берг Г., Чеботарь В.К., Тихонович И.А. Эндофитные бактерии сфагновых мхов как перспективные объекты сельскохозяйственной микробиологии. Микробиология, 2013, 82(3): 312-322.
8. Pankratov T.A., Ivanova A.O., Dedysh S.N., Liesack W. Bacterial populations and environmental factors controlling cellulose degradation in an acidic Sphagnum peat. Environmental Microbiology, 2011, 13(7): 1800-1814.
9. Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Целлюлозолитические стрептомицеты из сфагновых болот и факторы, определяющие их активность. Микробиология, 2009, 78(2): 261-267.
10. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Колотилова Н.Н. и др. Практикум по микробиологии: уч. пос. М., 2005.
61
11. Kasana R., Salwan R., Dhar H., Dutt S., Gulati A. A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Curr. Microbiol., 2006, 57(5): 503-507.
12. Коростик E.B., Пинаев А.Г., Ахтемова Г.А., Андронов Е.Е. Универсальные 16S рРНК праймеры BD1 для описания генетического разнообразия сообщества почвенных прокариот. Экологическая генетика, 2006, 4(4): 32-37.
13. Русакова И.В., Воробьев Н.И. Способ эффективного использования соломы в качестве удобрения с применением биопрепарата Баркон. Владимир, 2010.
14. Русакова И.В., Воробьев Н.И. Использование биопрепарата Баркон для иноку-лирования соломы, применяемой в качестве удобрения. Достижения науки и техники АПК, 2011, 8: 25-28.
15. Русакова И.В., Воробьев Н.И. Влияние биопрепарата Баркон на процессы гумификации соломы. Агрохимия, 2011, 1: 48-55.
16. Шарков И.Н. Определение интенсивности продуцирования СО2 почвой адсорбционным методом. Почвоведение, 1984, 7: 136-143.
17. Казеев К.Ш., Колесников С.И., Вальков В.Ф. Биологическая диагностика и индикация почв: методология и методы исследований. Ростов-на-Дону, 2003.
18. ГОСТ 26107-84 Почвы. Методы определения общего азота. М., 1984.
19. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М., 1985.
1ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
микробиологии Россельхозакадемии, 28 августа 2013 года
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: avsherbakov@bisolbi.ru, falenki@hotmail.com, vorobyov@arriam.spb.ru, vladchebotar@rambler.ru;
2ГНУ Всероссийский научно-исследовательский, конструкторский и проектно-технологический институт органических удобрений и торфа Россельхозакадемии,
601390 Россия, Владимирская обл., пос. Вяткино;
3Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины,
03041 Украина, г. Киев, ул. Героев обороны, 15, e-mail: alonagonchar@mail.ru
AEROBIC CELLULOLYTIC COMMUNITY ASSOCIATED WITH Sphagnum fallax AS A BASE FOR CROP RESIDUES DESTRUCTION PROCESSES
A.V. Shcherbakov1, I.V. Rusakova2, O.V. Orlova1, N.I. Vorobyov1, O.V. Sviridova1,
E.N. Shcherbakova3, V.K. Chebotar1
All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology of the Russian Academy of Agricultural Sciences, 3, sh. Podbelskogo, Pushkin, Saint Petersburg, 196608 Russia, e-mail avsherbakov@bisolbi.ru, falenki@hotmail.com, vorobyov@arriam.spb.ru, vladchebotar@rambler.ru;
2Russian Research Institute of Organic Fertilizers and Peat of the Russian Academy of Agricultural Sciences, 1, ul. Pryanishnikova, Vladimir Region, 601390 Russia;
3National University of Life and Environmental Science of Ukraine, 15, ul. Geroev oborony, Kiev, 03041 Ukraine, email alonagonchar@mail.ru
Abstract
At present, the agricultural practice has the actual problem of waste products utilization, in particular the most pressing question is the crop residues degradation. From Sphagnum fallax (H. Klinggr.) H. Klinggr., by the method of enrichment cultures we have isolated the aerobic cellulolytic community, which was stable in periodical cultivations on liquid mineral medium with cellulose. The taxonomic position of the five dominant community components was established and their physiological and biochemical properties were studied. The field experiments, in which barley straw was treated with the culture of celluloselytic community, or Bacillus subtilis Ch-13, or microbial preparation Barkon (ARRIAM, Russia) showed their impact on the processes of humification and straw mineralization in soil under specialized grain rotation. The effectiveness of studied cellulolytic microorganisms community in the processes of mineralization and humification of barley stubble was proved on the basis of changes in the following indicators: increase the number of microorganisms-destructors of fresh organic matter, increasing the rate of mineralization and microbial biomass content, increase the CO2 emissions, increase the actual cellulolytic activity and the content of readily degradable organic matter. Cellulolytic activity of association was the highest for the initial period after inoculation and straw incorporation into the soil.
Keywords: Sphagnum mosses, cellulolytic bacterial community, destruction of crops straw.
62
