CC BY
18
© Коллектив авторов, 2023
Шиловский И.П.1, Тимотиевич Е.Д.1, Юмашев К.В.1, Русак Т.Е.1' 2, Вишнякова Л.И.1, Никонова А.А.1 3, Смирнов В.В.1 2, Кофиади И.А.1, Брылина В.Е.4, Сергеев И.В.1, Маерле А.В.1, Кудлай Д.А.1 2, Хаитов М.Р.1 5
Аддитивный эффект синтетических малых интерферирующих РНК в отношении респираторно-синцитиального вируса
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 105064, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва, Российская Федерация
5 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из самых распространенных патогенов в мире. Он вызывает тяжелые заболевания верхних и нижних дыхательных путей. Ежегодно от РСВ-инфекции в мире умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. Эффективных, безопасных и при этом доступных методов лечения пациентов с РСВ-инфекцией до сих пор не создано. С открытием явления интерференции РНК - механизма негативной регуляции активности генов молекулами малых интерферирующих РНК (миРНК) - появились новые возможности для создания эффективных специфических лекарственных средств, в том числе противовирусных.
Цель данной работы - создание молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ и исследование их антивирусной активности in vitro.
Материал и методы. Проектирование молекул миРНК осуществляли in silico с использованием биоинформационного программного обеспечения. Антивирусную активность изучали в экспериментах in vitro на культуре клеток HEp-2. Клетки трансфе-цировали молекулами миРНК, после чего оценивали вирусную нагрузку с помощью количественного ПЦР-анализа и титрования на монослое чувствительных клеток МА-104.
Результаты. В отдельных экспериментах мы показали, что из трех чувствительных к вирусу клеточных линий клетки НЕр-2 более пригодны для тестирования антивирусной активности миРНК, поскольку они легче трансфецируются. В результате тестирования 4 вариантов миРНК против жизненно важных генов вируса (генов n и p) было установлено, что 2 варианта (siN-745 - против гена n и siP4 - против гена p) обладают наиболее выраженным антивирусным эффектом, снижая титр вируса более чем в 10 раз. При этом одновременное использование двух вариантов миРНК обеспечивает более выраженный (аддитивный) противовирусный эффект, снижая репликацию вируса почти в 100 раз. Данный эффект, возможно, связан с тем, что геныp и n играют различную роль в жизненном цикле вируса. Ген p кодирует фермент репликации, ген n - нуклеопротеин, защищающий геном вируса от деградации.
Заключение. Показано, что одновременное применение двух вариантов миРНК, направленных против консервативных генов n иp РСВ, позволяет добиться более выраженного противовирусного эффекта в сравнении с использованием индивидуальных миРНК против отдельных генов. Созданная композиция молекул миРНК может быть использована в составе противовирусных препаратов, направленных против РСВ.
Ключевые слова: миРНК; РНК-интерференция; вирус; респираторно-синцитиальный вирус
Статья получена 05.05.2023. Принята в печать 19.07.2023.
Для корреспонденции
Шиловский Игорь Петрович -доктор биологических наук, заместитель директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Для цитирования: Шиловский И.П., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Русак Т.Е., Вишнякова Л.И., Нико-нова А.А., Смирнов В.В., Кофиади И.А., Брылина В.Е., Сергеев И.В., Маерле А.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Аддитивный эффект синтетических малых интерферирующих РНК в отношении респираторно-синцитиаль-ного вируса. Иммунология. 2023; 44 (4): 419-428. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-4-419-428
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-25-00182 (https://rscf.ru/project/22-25-00182).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шиловский И.П., Хаитов М.Р.; сбор и обработка материала - Тимотиевич Е.Д., Вишнякова Л.И., Юмашев К.В., Русак Т.Е., Сергеев И.В., Маерле А.В.; статистическая обработка - Шиловский И.П., Кофиади И.А.; написание текста - Шиловский И.П., Тимотиевич Е.Д.; редактирование - Кудлай Д.А., Никонова А.А., Смирнов В.В., Брылина В.Е.; утверждение окончательного варианта статьи - Шиловский И.П., Смирнов В.В., Хаитов М.Р.
Shilovskiy I.P.1, Timotievich E.D.1, Yumashev K.V.1, Rusak T.E.1' 2, Vishnyakova L.I.1, Nikonova A.A.1' 3, Smirnov V.V.1' 2, Kofiadi I.A.1, Brylina V.E.4, Sergeev I.V.1, Maerle A.V.1, Kudlay D.A.1 2, Khaitov M.R.1 5
Additive effect of synthetic small interfering RNAs targeted to respiratory syncytial virus
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
3 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 105064, Moscow, Russian Federation
4 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skryabin of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 109472, Moscow, Russian Federation
5 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The respiratory syncytial virus (RSV) is one of the most prevalent pathogens. It causes severe diseases of the upper and lower respiratory tract. Annually, millions of children worldwide at age under 5 years old are dying from RSV. Effective, safe, and affordable ways of RSV treatment have not yet been developed. Discovery of RNA-interference phenomenon -a mechanism of negative gene regulation by small interfering RNA (siRNA) molecules - opened new opportunities in the development of novel specific effective drugs, including antivirals.
The aim of this study was to develop siRNA molecules against vitally important RSV genes and study its antiviral activity in vitro.
Material and methods. The design of siRNAs was carried out in silico using bioinformatic software. Antiviral activity was studied in the in vitro experiments on HEp-2 cell culture. Cells were transfected with siRNAs followed by infection and measurement of viral load by quantitative PCR and titration on a monolayer of sensitive MA-104 cells.
Results. First of all, we showed that HEp-2 cells out of the three virus-susceptible cell lines were more suitable for testing siRNA antiviral activity, as they are easier to transfect. Out of four screened siRNAs designed against vitally important RSV genes (n and p genes) two variants (siN-745 - against the n gene and siP4 - against the p gene) exhibited the most pronounced antiviral effect, reducing the virus titer by more than 10 times. The simultaneous use of these two siRNA variants provides even more pronounced (additive) antiviral effect, reducing virus replication by almost 100 times. Perhaps, such effect could be due to the fact that the p and n genes play different roles in RSV life cycle. Thep gene encodes the replication enzyme and the n gene encodes the nucleoprotein that protects the virus genome from degradation.
Conclusion. We have shown that the simultaneous use of two siRNAs targeted to conserved n and p genes of the virus makes it possible to achieve a more pronounced antiviral effect compared to application of individual siRNAs. The developed siRNA variants can be used in the composition of antiviral drugs against RSV.
Keywords: siRNA; RNA interference; virus; respiratory syncytial virus
For correspondence
Igor P. Shilovskiy -Dr.Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Received 05.05.2023. Accepted 19.07.2023.
For citation: Shilovskiy I.P., Timotievich E.D., Yumashev K.V., Rusak T.E., Vishnyakova L.I., Nikonova A.A., Smirnov V.V., Kofiadi I.A., Brylina V.E., Sergeev I.V., Maerle A.V., Kudlay D.A., Khaitov М.R. Additive effect of synthetic small interfering RNAs targeted to respiratory syncytial virus. Immunologiya. 2023; 44 (4): 419-28. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-4-419-428 (in Russian)
Funding. The study was supported by Russian Science Foundation grant No. 22-25-00182 (https://rscf.ru/ project/22-25-00182).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors contribution. Study conception and design - Shilovskiy I.P., Khaitov M.R.; material collection and processing - Timotievich E.D., Nikolskii A.A., Vishnyakova L.I., Yumashev K.V., Rusak T.E., Sergeev I.V., Maerle A.V.; statistical processing - Shilovskiy I.P., Kofiadi I.A.; manuscript preparation - Shilovskiy I.P., Timotievich E.D.; editing - Kudlay D.A., Nikonova A.A., Smirnov V.V., Brylina V.E.; approval of the final version of the article -Shilovskiy I.P., Smirnov V.V., Khaitov M.R.
Введение
Заболевания, вызываемые вирусными инфекциями дыхательных путей, занимают 1-е место по распространенности среди всех вирусных патологий. Наиболее значимыми патогенами являются респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирус (РВ), вирус гриппа и коронавирусы. На эти патогены приходиться до 90 % всех случаев инфекционных заболеваний [1]. Один из самых распространенных вирусных патогенов - РСВ. Он поражает нижние дыхательные пути, что в ~ 40 % случаев сопровождается тяжелым брон-хиолитом и пневмонией. Ежегодно в мире госпитализируется до 3 млн детей, инфицированных РСВ, при этом смертность от этой инфекции составляет 66-199 тыс. в год [2]. К особенностям этого вируса также можно отнести то, что перенесенная инфекция не вызывает стойкого иммунитета, что приводит к реин-фекциям [3]. Помимо непосредственного участия в развитии инфекции дыхательных путей, РСВ является значимым триггером в осложнениях других заболеваний, в частности бронхиальной астмы (БА), что в некоторых случаях может приводить к летальному исходу. Таким образом, РСВ-инфекция опасна не только своим прямым негативным действием на организм человека, но и тем, что является триггером других патологий дыхательных путей [4].
Эффективной вакцины против РСВ в настоящее время не существует. Созданная в 1960-х гг. вакцина сенсибилизировала детей к РСВ и в 80 % случаев вызывала развитие тяжелых осложнений, таких как пневмония и бронхиолит, приведших к госпитализации и даже гибели двух детей из вакцинированной группы.
Вакцины, созданные спустя 30 лет, также не были эффективны по различным причинам: одни вызывали острую РСВ-инфекцию, другие оказывали отсроченное вирулентное действие либо не вызывали адекватного иммунного ответа [5].
Существует опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих моноклональных антител ЮГУ (Respigam), паливизумаб (Synagis), ЫЕБГ-524 (№таЪ), мотавизимаб [6-8]. Клинические исследования этих препаратов продолжаются, однако их применение будет ограничено высокой стоимостью.
Кроме того, недавно фармацевтическая компания Regeneron Pharmaceuticals (США) сообщила о приостановке клинического исследования препарата суптави-зимаб против РСВ ввиду того, что не была достигнута основная конечная точка исследования: предотвращение инфицирования младенцев РСВ [9].
За последние 15 лет разработан ряд низкомолекулярных органических соединений, которые были способны ингибировать проникновение РСВ в клетки за счет связывания их с F-белком РСВ (блокирование слияния вируса с клеткой). Однако в результате мутаций F-белка возникали варианты РСВ, устойчивые к ингибиторам [10].
В настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин) [11], однако он вызывает многочисленные побочные эффекты [12]. Ведутся работы над созданием новых терапевтических средств, например пептидных ингибиторов [13, 14], наночастиц [15] и различных малых молекул [16].
Таким образом, эффективных, безопасных и при этом доступных методов лечения РСВ-инфекции до сих пор не разработано. Это определяет актуальность разработки новых противовирусных препаратов.
Открытие в 1998 г. явления интерференции РНК как способа регуляции генной экспрессии на посттраскрип-ционном уровне дало новые возможности для разработки лекарственных средств, которые могут применяться в том числе для лечения вирусных инфекций. Синтезируя молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК) с заданной нуклеотидной последовательностью, можно подавлять экспрессию любого гена с известной нуклеотидной последовательностью [17, 18], в том числе генов патогенных вирусов [19, 20].
К настоящему времени секвенированы геномы многих вирусов, в том числе геном РСВ. Он представлен несегментированной одноцепочечной молекулой РНК негативной полярности, длина которой составляет 15 200 нуклеотидных оснований, и содержит 10 генов, кодирующих 11 белков [21, 22].
РСВ имеет 3 поверхностных гликопротеина: малый гидрофобный протеин SH (small hydrophobic), белок слияния F (fusion protein) и гликопротеин прикрепления G (attachment glycoprotein).
Характерная особенность РСВ - индукция образования массы слившихся, утративших свою нормальную структуру инфицированных клеток, называемой синцитием, от которого РСВ и получил свое название. Белок слияния F играет основную роль в процессе образования синцитиев. Противовирусная активность антител in vitro и in vivo определяется именно связыванием с белками G и F [8]. Функция белка SH не известна. Белки нуклео-капсида включают нуклеопротеин N, фосфопротеин P, матриксные протеины М1, М2-1, M2-2 и протеин L.
Белок M2-1 (также называемый 22К или матриксный протеин) - фактор элонгации транскрипции. Ген M2 содержит вторую открытую рамку считывания, которая кодирует белок М2-2, участвующий в регуляции транскрипции. Матриксный протеин М1 участвует в процессе упаковки вируса [21, 22].
Закодированные в геноме РСВ два неструктурных белка, NS1 и NS2, по некоторым данным, могут угнетать интерфероновый антивирусный ответ [23]. Особо важную роль в репликации РСВ играют три белка: белок нуклеокапсида N, окружающий негативную геномную цепь РНК и комплементарную ей позитивную антигеномную РНК в цитоплазме клетки, предотвращая их гидролиз нуклеазами; белок L, являющийся главной субъединицей РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), и фосфопротеин Р, являющийся малой субъединицей RdRp и необходимым транскрипционным фактором [21, 22, 24].
Цель данной работы - проектирование миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, и изучение их противовирусных свойств in vitro.
Материал и методы
Культура клеток и вирусный штамм. В работе использовали РСВ штамм А2, предоставленный ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова Минобрнауки России. Использовали клетки карциномы гортани человека HEp-2, карциномы легкого человека А549 и эмбриональной почки зеленой мартышки МА-104 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, подразделение ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).
Проектирование миРНК к генам РСВ. Проектирование последовательностей миРНК осуществлялось с помощью программы OligoWalk [http://rna.urmc. rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_ form.cgi]. Синтез молекул миРНК, их очистка, а также подтверждение чистоты и подлинности осуществлялся компанией ООО «ДНК-Технология» (Россия).
Оценка активности люциферазы. В 24-луночный планшет засевали клетки линий HEp-2, А549 и МА-104 в количестве 200 тыс./лунку в 0,6 мл полной питательной среды ДМЕМ (ПанЭко, Россия). Инкубировали в течение ночи до образования монослоя, после чего осуществляли трансфекцию 0,5 мкг плазмиды pGL3 (Promega, США) и 1 мкл Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Через сутки после трансляции клетки лизировали и оценивали актив-
ность люциферазы при помощи набора Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, США). Данные представляли в виде RLU/200 000 клеток, где RLU - количество относительных световых единиц (RLU - relative light unit).
Оценка противовирусного эффекта молекул миРНК. Для оценки противовирусных свойств молекул миРНК клетки НЕр-2 трансфецировали спроектированными миРНК с использованием коммерческого реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) (0,5 мкг миРНК/200 тыс. кл.). В качестве отрицательного контроля клетки трансфецировали таким же количеством неспецифических молекул миРНК против гена gfp (siGFP). Через 4 ч после трансфекции клетки инфицировали вирусом РСВ штамм А2 при MOI = 0,1 в течение 2 ч, после чего повторяли трансфекцию и инкубировали в течение 3 сут. Затем собирали супер-натант и хранили его при -20 °С до анализа с помощью титрования, а монослой клеток лизировали в буфере RLT (Qiagen, США) и хранили его при -20 °С до анализа с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Оценка вирусной нагрузки. Вирусную нагрузку оценивали с помощью количественной ПЦР. Для этого из клеточных лизатов выделяли общую РНК. 1-2 мкг РНК использовали в реакции обратной транскрипции с использованием случайного гексамерного праймера и набора реагентов ОТ-1 (Синтол, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Далее 3 мкл кДНК использовали в реакции количественной ПЦР с применением набора реагентов ОТ-1 производства компании «Синтол», специфических праймеров и зонда: F GAAGCATTAATGACCAATGA, R CATCTGATGTGTCTTTTGC, Z (ROX) GCTATGGCAAGACTCAGGAATGAG (RTQ2). Синтез праймеров и зонда осуществляли в компании «Синтол» (Россия). ПЦР осуществляли с использованием ампли-фикатора IQ5 (BioRad, США).
Также вирусную нагрузку определяли с помощью титрования на монослое чувствительных клеток МА-104. Для этого в 96-луночный планшет засевали клетки в количестве 20 тыс./лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды БМЕМ (Gibco, США), содержащей 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия), 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение ночи при 37 ° в атмосфере 5 % СО2 до образования монослоя. После чего клетки промывали физиологическим раствором (ПанЭко, Россия) (200 мкл/лунку), вносили в них безсывороточную среду БМЕМ, содержащую 600 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES, и титровали супернатанты с шагом разведения 10 раз. Затем клетки инкубировали 3-5 сут и оценивали титр вируса с помощью световой микроскопии по образовавшимся на монослое синцитиям (бляшкам). Титр вируса рассчитывали по формуле Спирмена-Кербера.
Результаты
Проектирование молекул миРНК
Молекулы миРНК против гена р были спроектированы и изучены в экспериментах in vitro и in vivo в предшествующих работах [25, 26]. Ген p кодирует фосфопротеин Р, который является субъединицей RdRp и участвует в транскрипции мРНК генов РСВ и в репликации генома вируса. Было продемонстрировано, что наибольшей антивирусной активностью обладают два варианта - siP2 и siP4 [25, 26] (см. таблицу).
С использованием программного обеспечения OligoWalk было спроектировано 43 варианта молекул миРНК против другого жизненно важного гена РСВ -n, который кодирует нуклеопротеин N - белок, связывающийся с геномной РНК вируса в клетке и защищающий ее от клеточных нуклеаз. Из 43 вариантов были выбраны для синтеза и изучения в экспериментах in vitro 2 варианта миРНК (см. таблицу). При выборе миРНК мы руководствовались результатами прогнозирования биологической активности молекул миРНК и рассматривали варианты миРНК с высокой теоретической активностью. Помимо этого, осуществлялся поиск последовательностей спроектированных молекул миРНК среди последовательностей генома человека. Из исследования исключались те варианты миРНК, которые имели высокое сходство с последовательностями в геноме человека, чтобы избежать off-target-эффектов. В исследование включали миРНК, имеющие не более 84 % идентичности с последовательностями в геноме человека.
Подбор модельной клеточной линии
В мировых научных публикациях описано по меньшей мере 3 культуры клеток, чувствительных к РСВ: МА-104 - клетки эмбриональной почки зеленой мартышки, HEp-2 - клетки эпидермоидной карциномы гортани человека, А549 - клеточная линия бронхиальной карциномы человека [8, 27]. Мы оценили способность указанных клеточных линий быть трасфециро-ванными. Для этого с помощью коммерческого реагента Lipofectamine 2000 вводили в них плазмидную ДНК pGL3, несущую репортерный ген люциферазы, с последующим определением активности данного фермента в клеточных лизатах.
Мы показали, что клеточная линия HEp-2 является оптимальной для трансфекции спроектированных молекул миРНК. Активность люциферазы в лизатах этих клеток достигала 5 000 000 RLU/200 тыс. кл., в то время как в лизатах клеток А549 и МА-104 активность люциферазы была меньше в 5 и 70 раз соответственно (рис. 1). Дальнейшее изучение противовирусных свойств миРНК мы проводили на культуре HEp-2.
Оценка противовирусных свойств молекул миРНК in vitro
Для изучения противовирусной активности спроектированных миРНК клетки HEp-2 трансфецировали индивидуальными молекулами миРНК, после чего осуществляли инфекцию клеток вирусом и повторяли
Нуклеотидные последовательности спроектированных молекул миРНК
Название миРНК Антисмыслововая последовательность миРНК (5'-3')
siP2 UGAUCUAUCACUUGAAGAU
siP4 GCAAGUGCAGGACCUACAU
siN-745 UUGCCCUGCACCAUAGGCA
siN-979 UGCUGCUGGCCUAGGCAUA
трансфекцию (как описано выше). Спустя 3 сут супер-натант собирали и анализировали с помощью титрования, а клетки лизировали, выделяли РНК и определяли количество копий геномной РНК. Обнаружено, что наибольший противовирусный эффект обеспечивали варианты миРНК siN-745 и siP4, которые подавляли репликацию РСВ до 10 раз в сравнении с использованием контрольной миРНК - siGFP, что свидетельствует о сиквенс-специфическом подавлении репликации РСВ в клетке (рис. 2).
Поскольку гены n и p играют различную роль в репликации вируса, мы предположили, что одновременное подавление указанных генов может оказывать аддитивный противовирусный эффект. В серии экспериментов мы оценили аддитивный эффект миРНК siN-745 и siP4. Для этого использовали ту же модель инфекции in vitro (HEp-2/РСВ) с незначительными изменениями - трансфекцию клеток молекулами миРНК осуществляли однократно. Одновременное применение молекул миРНК siN-745 и siP4 приводило к почти 100-кратному подавлению вирусной нагрузки в инфицированных клетках. Таким образом, наблюдается аддитивный эффект исследованных миРНК (рис. 3).
Обсуждение
В данной работе показано, что спроектированные молекулы миРНК способны подавлять репликацию РСВ в экспериментах in vitro. Для проектирования молекул миРНК были выбраны два гена-мишени: n и p.
5 000 000
и 500 000
Sí
50 000
0
0 0 5000
0
0 (N 500
sá 50
5
МА-104 Hep-2
А549
pGL3
Рис. 1. Подбор оптимальной культуры клеток для изучения противовирусных свойств молекул миРНК Клетки бъти трансфецированы 0,5 мкг плазмиды pGL3 и 1 мкл реагента Lipofectamine 2000. Через сутки оценивали люминесценцию лизатов клеток. N = 3.
э
%
120
100 80 60 40 20 0
Относительное количество вирусной РНК
э
%
120
100 80 60 40 20 0
Относительный титр РСВ
siN-745 siN-976 siP2 siP4 siGFP
siN-745 siN-976 siP2 siP4
siGFP
Рис. 2. Изучение противовирусных свойств молекул миРНК на культуре клеток НЕр-2
Клетки НЕр-2 бъти трансфецированы индивидуальными молекулами миРНК, после чего заражены вирусом и повторно транс-фецированы. Далее была проведена оценка вирусной нагрузки с помощью количественной ПЦР (А) и титрования на монослое клеток МА-104 (Б).
х - статистически значимо отличается от згОЕР, являющейся неспецифическим контролем. Различия принимались значимыми при р < 0,05. Сравнение выборок осуществлялось по непараметрическому критерию Краскела-Уоллиса. N = 6.
Первый кодирует нуклеопротеин N необходимый для предотвращения деградации геномной вирусной РНК в цитоплазме инфицированной клетки. Второй кодирует фосфопротеин Р, являющийся субъединицей РНК-полимеразы, необходимой для репликации вируса [21, 22]. Эти гены являются самыми консервативными в геноме РСВ [28, 29] Значимость этих генов для жизненного цикла вируса и высокая консервативность делают их привлекательными в качестве мишеней противовирусного воздействия с помощью целевых молекул миРНК.
РНК-интерференция - это высокоспецифичный процесс. Несовпадение спроектированных миРНК с последовательностью мишени на один нуклеотид
существенно снижает эффект генного сайленсинга, несовпадение на два нуклеотида и более полностью отменяет эффект РНК-интерференции.
Гены n и p ранее уже рассматривались различными коллективами исследователей в качестве мишеней. Так, в работе V Bitko и соавт. в 2001 г. были разработаны молекулы миРНК против гена р вируса [29]. В работе R. Alvarez и соавт. в качестве мишени выступал ген n как наиболее консервативный в геноме РСВ [28]. Также в качестве мишени для миРНК рассматривался ген f кодирующий белок слияния F, необходимый для проникновения вируса в клетку и способствующий образованию синцитиев (конгломерата слившихся инфицированных клеток). Однако, хотя подавление экспрессии
Э
%
120
100 80 60 40 20 0
Относительное количество вирусной РНК
= 0,09 -
р < 0,05 -
X X -
- гЪ X -
FPl
э
%
120
100 80 60 40 20 0
Относительный титр РСВ
siN-745 siP4
siN/Р
siGFP
siN-745
siP4
siN/Р
siGFP
Рис. 3. Аддитивный противовирусный эффект при одновременном применении миРНК 81Ы-745 и 81Р4
Клетки НЕр-2 быгли однократно трансфецированы индивидуальными молекулами миРНК или их смесью, после чего заражены вирусом. Далее быта проведена оценка вирусной нагрузки с помощью количественной ПЦР (А) и титрования на монослое клеток МА-104 (Б).
х - статистически значимо отличается от згОЕР, являющейся неспецифическим контролем. Различия принимались значимыми при р < 0,05. Сравнение выборок осуществлялось по непараметрическому критерию Краскела-Уоллиса. N = 7.
гена / ингибировало образование синцития, цитопати-ческий эффект вируса на клетки оставался [29]. В наших предыдущих исследованиях [25, 26, 30] мы создали молекулы миРНК против гена р с уникальными последовательностями, отличающимися от используемых в работе V. Бйко и соавт. [29], а также дополнительно спроектировали миРНК против уникальных последовательностей гена п.
В данном исследовании мы попытались оценить аддитивный эффект применения молекул миРНК против обоих генов (п и р) одновременно. Показано, что трансфекция клеток НЕр-2 обоими вариантами миРНК (б1Р4 и б1М-745) усиливала противовирусный эффект в 2-3 раза по сравнению с использованием индивидуальных миРНК.
Возможно, данный эффект связан с тем, что гены р и п играют различную роль в жизненном цикле вируса. Ген р кодирует фермент репликации, ген п - нуклео-протеин, защищающий геном вируса от деградации. Кроме того, М-белок косвенно способен участвовать в репликации генома РСВ. Большие количества этого белка в клетке переводят полимеразу ЯЛЯр в репли-кативный режим, в котором она реплицирует геном вируса, а не осуществляет транскрипцию отдельных его генов [31]. Таким образом, подавляя молекулами миРНК две различные стадии жизненного цикла вируса
(стадию репликации генома и процесс его упаковки), мы наблюдали усиленный (аддитивный) противовирусный эффект молекул миРНК.
Известен лекарственный препарат ALN-RSV01 производства Alnylam Pharmaceuticals (США), который прошел основные стадии клинических испытаний [32-34]. Действующим веществом этого препарата является модифицированная молекула миРНК против гена n РСВ. Проведенные R. Alvarez и соавт. исследования показали, что, несмотря на высокую консервативность гена n, в 9 % случаев участок гена, к которому направлен препарат ALN-RSV01, несет мутации, которые нивелируют его противовирусный эффект [28]. Таким образом, применение двух молекул миРНК, направленных к двум различным генам РСВ, будет оправдано не только с точки зрения большей противовирусной активности, но и с точки зрения уменьшения вероятности ухода вируса от действия препарата за счет мутаций.
Заключение
Осуществлен дизайн и синтез молекул миРНК против генов p и n, жизненно важных для репликации РСВ, и показан аддитивный противовирусный эффект при их совместном использовании in vitro. Созданная композиция молекул миРНК может быть использована в составе противовирусных препаратов, направленных против РСВ.
■ Литература
1. Fernandes-Matano L., Monroy-Munoz I., Angeles-Martinez J., Sarquiz-Martinez B. et al. Prevalence of non-influenza respiratory viruses in acute respiratory infection cases in Mexico. PLoS One. 2017; 12 (5): e0176298. DOI: https://10.1371/journal.pone.0176298.
2. Shi T., McAllister D., O'Brien K., Simoes E. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 2017; 390 (10098): 946-58. DOI: https://10.1016/S0140-6736(17)30938-8
3. Hall C.B., Weinberg G.A., Iwane M.K., Blumkin A.K. et al. The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. N. Engl. J. Med. 2009; 360 (6): 588-98. DOI: https://10.1056/NEJMoa0804877
4. Busse W.W., Lemanske R.F., Gern J.E. Role of viral respiratory infections in asthma and asthma exacerbations. Lancet. 2010; 376 (9743): 826-34. DOI: https://10.1016/S0140-6736(10)61380-3
5. Castilow E.M., Olson M.R., Varga S.M. Understanding respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Immunologic Research. 2007; 39 (1-3): 225-39. DOI: https://10.1007/s12026-007-0071-6
6. Paton J.Y. To Palivizumab or not to Palivizumab - that is the question. Paediatric Respiratory Reviews. 2013; 14 (2): 126-7. DOI: https://10.1016/j.prrv.2012.12.004
7. Yang C., Wang C., Malkin E., Schickli J. et al. Implication of respiratory syncytial virus (RSV) F transgene sequence heterogeneity observed in Phase 1 evaluation of MEDI-534, a live attenuated parainfluenza type 3 vectored RSV vaccine. Vaccine. 2013; 31 (26): 2822-7. DOI: https://10.1016/j.vaccine.2013.04.006
8. Huang K., Incognito L., Cheng X., Ulbrandt N. et al. Respiratory syncytial virus-neutralizing monoclonal antibodies motavizumab and palivizumab inhibit fusion. J. Virol. 2010; 84 (16): 8132-40. DOI: https://10.1128/JVI.02699-09
9. Simоes E., Forleo-Neto E., Geba G., Kamal M. et al. Suptavumab for the prevention of medically attended respiratory syncytial virus infection in preterm infants. Clin. Infect. Dis. 2021; 73 (11): e4400-8. DOI: https://10.1093/cid/ciaa951
10. Battles M., Langedijk J., Furmanova-Hollenstein P., Chaiwatpong-sakorn S. et al. Molecular mechanism of respiratory syncytial virus fusion inhibitors. Nat Chem Biol. 2016; 12 (2): 87-93. DOI: https://10.1038/ nchembio.1982
11. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc H., Pena-Lopez Y. Riba-virin for treatment of subjects with respiratory syncytial virus-related infection: a systematic review and meta-analysis. Advances in Therapy. 2022; 39 (9): 4037-51. DOI: https://10.1007/s12325-022-02256-5
12. Janai H., Marks M., Zaleska M., Stutman H. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr. Infect. Dis. J. 1990; 9 (3): 209-11. PMID: 2139930.
13. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A. et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncy-tial virus. Mol. Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI: https://10.1134/ S002689841904013X
14. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Barvin-skaia E.D. et al. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus. Allergy. 2019; 74 (S106): 1544. https://doi.org/10.1111/all.13999
15. Osminkina L.A., Timoshenko V.Yu., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V. et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. Journal of Nanoparticle Research. 2014; 16 (6). DOI: https://10.1007/s11051-014-2430-2
16. Heylen E., Neyts J., Jochmans D. Drug candidates and model systems in respiratory syncytial virus antiviral drug discovery. Biochemical Pharmacology. 2017; 127: 1-12. DOI: https://10.1016/j.bcp.2016.09.014
17. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391 (6669): 806-11. DOI: https://10.1038/35888
18. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 2004; 431 (7006): 343-9. DOI: https://10.1038/ nature02873
19. Хаитов М.Р., Литвин Л.С., Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н. и др. Интерференция РНК. Новые подходы к разработке противовирусных препаратов. Иммунология. 2010; 31 (2): 69-76.
20. Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P., Kozhikhova K.V. et al. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://10.1111/all.14850
21. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus - Viral biology and the host response. Journal of Infection. 2002; 45: 18-24. DOI: https://10.1053/jinf.2002.1015
22. Van Drunen Littel-Van Den Hurk S., Watkiss E.R. Pathogenesis of respiratory syncytial virus. Current Opinion in Virology. 2012; 2: 300-5. DOI: https://10.1016/j.coviro.2012.01.008
23. Schlender J., Bossert B., Buchholz U., Conzelmann K. Bovine respiratory syncytial virus nonstructural proteins NS1 and NS2 cooperatively antagonize alpha/beta interferon-induced antiviral response. J. Virol. 2000; 74 (18): 8234-42. DOI: https://10.1128/JVI.74.18.8234-8242.2000
24. Shilovskiy I.P., Yumashev K.V, Nikolsky A.A., Vishnya-kova L.I. et al. Molecular and cellular mechanisms of respiratory syncy-tial viral infection: using murine models to understand human pathology. Biochemistry (Moscow). 2021; 86 (3): 290-306. DOI: https://10.1134/ S0006297921030068
25. Шиловский И.П., Мазуров Д.В., Файзулоев Е.Б., Хаитов М.Р. shRNA опосредованное ингибирование репликации РСВ. Сообщение № 1: создание векторных конструкций для сайленсинга гена Р. Физиология и патология иммунной системы. 2011; 14 (7): 7-13.
26. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum. Gene. Ther. 2014; 25 (7): 642-50. DOI: https://10.1089/hum.2013.142
27. Mehedi M., Collins P., Buchholz U. A novel host factor for human respiratory syncytial virus. Commun. Integr. Biol. 2017; 10 (3): e1319025. DOI: https://10.1080/19420889.2017.1319025
28. Alvarez R., Elbashir S., Borland T., Toudjarska I. et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (9): 3952-62. DOI: https://10.1128/AAC.00014-09
29. Bitko V., Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol. 2001; 1: 1-11. DOI: https://10.1186/1471-2180-1-34
30. Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н., Мазуров Д.В., Файзулоев Е.Б. и др. Лентивирусная система доставки shRNA обеспечивает подавление репликации РСВ in vitro посредством активации механизма интерференции РНК. Иммунология. 2011; 32 (1): 6-11.
31. Wertz G., Howard M., Davis N., Patton J. The switch from transcription to replication of a negative-strand RNA virus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987; 52: 367-71. DOI: https://doi.org/10.1128/ JVI.77.10.5740-5748.2003
32. DeVincenzo J., Cehelsky J., Alvarez R., Elbashir S. et al. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV). Antiviral Res. 2008; 77 (3): 225-31. DOI: https://10.1016/j. antiviral.2007.11.009
33. DeVincenzo J., Lambkin-Williams R., Wilkinson T., Cehelsky J. et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107 (19): 8800-5. DOI: https://10.1073/pnas.0912186107
34. Simon A., Glanville A., Zamora M., Hodges T. et al. Results of a phase 2b multi-center, randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi therapeutic, ALN-RSV01, in respiratory syncytial virus (RSV)-infected lung transplant patients. European respiratory journal. 2012; 40: 1-17.
■ References
1. Fernandes-Matano L., Monroy-Munoz I., Angeles-Martinez J., Sarquiz-Martinez B. et al. Prevalence of non-influenza respiratory viruses in acute respiratory infection cases in Mexico. PLoS One. 2017; 12 (5): e0176298. DOI: https://10.1371/journal.pone.0176298
2. Shi T., McAllister D., O'Brien K., Simoes E. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 2017; 390 (10098): 946-58. DOI: https://10.1016/S0140-6736(17)30938-8
3. Hall C.B., Weinberg G.A., Iwane M.K., Blumkin A.K., et al. The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. N Engl J Med. 2009; 360 (6): 588-98. DOI: https://10.1056/NEJMoa0804877
4. Busse W.W., Lemanske R.F., Gern J.E. Role of viral respiratory infections in asthma and asthma exacerbations. Lancet. 2010; 376 (9743): 826-34. DOI: https://10.1016/S0140-6736(10)61380-3
5. Castilow E.M., Olson M.R., Varga S.M. Understanding respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Immunologic Research. 2007; 39 (1-3): 225-39. DOI: https://10.1007/s12026-007-0071-6
6. Paton J.Y. To Palivizumab or not to Palivizumab - that is the question. Paediatric Respiratory Reviews. 2013; 14 (2): 126-7. DOI: https://10.1016/j.prrv.2012.12.004
7. Yang C., Wang C., Malkin E., Schickli J., et al. Implication of respiratory syncytial virus (RSV) F transgene sequence heterogeneity observed in Phase 1 evaluation of MEDI-534, a live attenuated parainfluenza type 3 vectored RSV vaccine. Vaccine. 2013; 31 (26): 2822-7. DOI: https://10.1016/j.vaccine.2013.04.006
8. Huang K., Incognito L., Cheng X., Ulbrandt N., et al. Respiratory syncytial virus-neutralizing monoclonal antibodies motavizumab and palivizumab inhibit fusion. J Virol. 2010; 84 (16): 8132-40. DOI: https://10.1128/JVI.02699-09
9. Simoes E., Forleo-Neto E., Geba G., Kamal M., et al. Suptavumab for the prevention of medically attended respiratory syncytial virus infection in preterm infants. Clin Infect Dis. 2021; 73 (11): e4400-8. DOI: https://10.1093/cid/ciaa951
10. Battles M., Langedijk J., Furmanova-Hollenstein P., Chaiwatpong-sakorn S. et al. Molecular mechanism of respiratory syncytial virus fusion inhibitors. Nat Chem Biol. 2016; 12 (2): 87-93. DOI: https://10.1038/ nchembio.1982
11. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc H., Pena-Lopez Y. Ribavirin for treatment of subjects with respiratory syncytial virus-related infection: a systematic review and meta-analysis. Advances in Therapy. 2022; 39 (9): 4037-51. DOI: https://10.1007/s12325-022-02256-5
12. Janai H., Marks M., Zaleska M., Stutman H. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr Infect Dis J. 1990; 9 (3): 209-11. PMID: 2139930.
13. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A. et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncytial virus. Mol Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI: https://10.1134/S0026898419 04013X
14. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Barvin-skaia E.D. et al. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus. Allergy. 2019; 74 (S106): 1544. DOI: https://doi.org/10.1111/all.13999
15. Osminkina L.A., Timoshenko V.Yu., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V., et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. Journal of Nanoparticle Research. 2014; 16 (6). DOI: https://10.1007/s11051-014-2430-2
16. Heylen E., Neyts J., Jochmans D. Drug candidates and model systems in respiratory syncytial virus antiviral drug discovery. Biochemical Pharmacology. 2017; 127: 1-12. DOI: https://10.1016/j.bcp.2016.09.014
17. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391 (6669): 806-11. DOI: https://10.1038/35888
18. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 2004; 431 (7006): 343-9. DOI: https://10.1038/ nature02873
19. Khaitov M.R., Litvin L.S., Shilovskiy I.P., Bashkatova Yu.N., et al. RNA interference new approaches to the development of antiviral agents. Immunologiya. 2010; 31 (2): 69-76. (in Russian)
20. Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P., Kozhikhova K.V., et al. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://10.1111/ all.14850
21. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus - Viral biology and the host response. Journal of Infection. 2002; 45: 18-24. DOI: https://10.1053/jinf.2002.1015
22. Van Drunen Littel-Van Den Hurk S., Watkiss E.R. Pathogenesis of respiratory syncytial virus. Current Opinion in Virology. 2012; 2: 300-5. DOI: https://10.1016/j.coviro.2012.01.008
23. Schlender J., Bossert B., Buchholz U., Conzelmann K. Bovine respiratory syncytial virus nonstructural proteins NS1 and NS2 cooperatively antagonize alpha/beta interferon-induced antiviral response. J Virol. 2000; 74 (18): 8234-42. DOI: https://10.1128/JVI.74.18.8234-8242. 2000
24. Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Nikolsky A.A., Vishnyakova L.I. et al. Molecular and cellular mechanisms of respiratory syncytial viral infection: using murine models to understand human pathology. Biochemistry (Moscow). 2021; 86 (3): 290-306. DOI: https://10.1134/ S0006297921030068
25. Shilovskiy I.P., Mazurov D.V., Faizuloev E.B., Khaitov M.R. shRNA mediated inhibition of RSV №1: The development of vector constructions for respiratory syncitial virus (RSV) P-gene silencing. Physiology and pathology of the immune system. 2011; 14 (7): 7-13. (in Russian)
26. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum Gene Ther. 2014; 25 (7): 642-50. DOI: https://10.1089/hum.2013.142
27. Mehedi M., Collins P., Buchholz U. A novel host factor for human respiratory syncytial virus. Commun Integr Biol. 2017; 10 (3): e1319025. DOI: https://10.1080/19420889.2017.1319025
28. Alvarez R., Elbashir S., Borland T., Toudjarska I., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleo-
Сведения об авторах
Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Тимотиевич Екатерина Драгановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Юмашев Кирилл Валерьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Русак Татьяна Евгеньевна - студент ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Вишнякова Людмила Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Никонова Александра Александровна - канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова Минобрнауки России; мл. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9610-0935
capsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (9): 3952-62. DOI: https://10.1128/AAC.00014-09
29. Bitko V., Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol. 2001; 1: 1-11. DOI: https://10.1186/1471-2180-1-34
30. Shilovskiy I.P., Bashkatova Yu.N., Mazurov D.V., Faizuloev E.B., et al. A lentivirus system for shRNA delivery ensures in vitro suppression of RSV replication by activation of the mechanism of RNA. Immu-nologiya. 2011; 32(1): 6-11. (in Russian)
31. Wertz G., Howard M., Davis N., Patton J. The switch from transcription to replication of a negative-strand RNA virus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987; 52: 367-71. DOI: https://doi.org/10.1128/ JVI.77.10.5740-5748.2003
32. DeVincenzo J., Cehelsky J., Alvarez R., Elbashir S., et al. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV). Antiviral Res. 2008; 77 (3): 225-31. DOI: https://10.1016/j. antiviral.2007.11.009
33. DeVincenzo J., Lambkin-Williams R., Wilkinson T., Cehelsky J., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107 (19): 8800-5. DOI: https://10.1073/pnas.0912186107
34. Simon A., Glanville A., Zamora M., Hodges T., et al. Results of a phase 2b multi-center, randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi therapeutic, ALN-RSV01, in respiratory syncytial virus (RSV)-infected lung transplant patients. European respiratory journal. 2012; 40: 1-17.
Authors' information
Igor P. Shilovskiy - Dr. Sci, PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Ekaterina D. Timotievich - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Kirill V. Yumashev - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Tatyana E. Rusak - Student, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Lab. Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2671-4063
Lyudmila I. Vishniakova - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Aleksandra A. Nikonova - PhD, Head of Molecular Biotechnology Laboratory of I.I. Mechnikov NIIVS MSHE of Russia; Junior Researcher of the Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9610-0935
Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. научно-производственным комплексом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института фармации им. А.П. Нелю-бина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Кофиади Илья Андреевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Брылина Вера Евгеньевна - канд. вет. наук, доцент кафедры иммунологии и биотехнологии МГАВМиБ МВА им. К. И. Скрябина Минсельхоза России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Сергеев Илья Викторович - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и гистосовместимости человека ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected]
Маерле Артем Владимирович - науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и гистосовместимости человека ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Кудлай Дмитрий Анатольевич - член-корр. РАН, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармакологии Института фармации им. А.П. Нелюбина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зав. каф. иммунологии МБФ РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
Valery V. Smirnov - Dr.Sci., Head of Research and production complex, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair n.a. A.P. Arzamastsev, Institute of Pharmacy n.a. A.P. Neliubin, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Ilya A. Kofadi - D.Sci., PhD, Head of the Molecular Immunogenetics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Vera E. Brylina - PhD, Associate Professor of the Immunology and Biotechnology Chair, MVA named after K.I. Skryabin, MOA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Ilya V. Sergeev - PhD, Senior Researcher of Immunogenetics Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Artem V. Maerle - Researcher of Immunogenetics Dept., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Dmitry A. Kudlay - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Leader Researcher of the Personalized Medicine and Molecular Immunology Lab., NRC Institute of Immunology FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Chair, Institute of Pharmacy n.a. A.P. Neliubin, I.M. Sechenov 1st MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Prof., Director, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Head of the Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
